本文關(guān)鍵詞：假單胞菌DLL-E4中pnp基因簇LysR家族調(diào)控因子分析　出處：《南京農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：對(duì)硝基苯酚(p-nitrophenol,PNP)是化工領(lǐng)域中相當(dāng)重要的有機(jī)合成中間體,被廣泛應(yīng)用于化工染料、醫(yī)藥、農(nóng)藥等精細(xì)化學(xué)品的合成。PNP可經(jīng)皮膚、呼吸道、消化道等被身體吸收,對(duì)人類(lèi)的生產(chǎn)、生活以及健康帶來(lái)巨大影響。自19世紀(jì)以來(lái),研究者已從環(huán)境中分離出來(lái)自不同種屬的降解PNP的微生物資源,如今關(guān)于PNP的微生物代謝更多集中在分子機(jī)制上的研究,但關(guān)于PNP調(diào)控機(jī)制的報(bào)道相對(duì)較少。Pseudomonas putida DLL-E4是本實(shí)驗(yàn)室從長(zhǎng)期受有機(jī)磷農(nóng)藥污染的土壤中分離出的一株高效降解PNP的菌株。P.putida DLL-E4中有兩套PNP代謝基因簇(pnp),目前本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)研究并報(bào)道了 LysR家族調(diào)控蛋白PnpR在PNP代謝調(diào)控中的作用。由pnpR進(jìn)行基因沉默的方式表明pnpR以正調(diào)控的方式調(diào)控pnp基因簇的下游對(duì)苯二酚(HQ)代謝相關(guān)基因(pnpC1C2DE),但是PnpR對(duì)pnp中的脫硝基類(lèi)相關(guān)基因即pnpBA無(wú)調(diào)控作用。單組分黃素單加氧酶PnpA是P.putida DLL-E4中PNP代謝的起始酶,將PNP降解HQ,其轉(zhuǎn)錄和翻譯情況對(duì)菌株代謝PNP速率有決定性影響,因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)不同的手段篩檢菌株DLL-E4中脫硝基類(lèi)相關(guān)調(diào)控基因。本研究以P.putida DLL-E4作為實(shí)驗(yàn)材料,利用轉(zhuǎn)座子插入失活法篩選PNP降解性能丟失的突變菌株。在排除pnpA基因突變的情況下,獲得2株突變株J1、J4不能降解PNP。利用SEFA-PCR擴(kuò)增突變子兩側(cè)側(cè)翼序列,找到轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn),擴(kuò)增 J1 插入位點(diǎn)下游 1998bp,插入位置在 cyclopropane-fatty-acyl-phospholipid synthase編碼區(qū),這是一個(gè)環(huán)丙烷脂肪�；字铣擅�。J4插入位點(diǎn)為5230809,該位置編碼new RNA_214,該RNA調(diào)控PNP的降解。以P.putida DLL-E4作為實(shí)驗(yàn)材料對(duì)其進(jìn)行全基因組框架圖測(cè)序,結(jié)果表明菌株DLL-E4的基因組長(zhǎng)度約為6.43M,GC含量約62.44%,共計(jì)190個(gè)Scaffold,223個(gè)Contig。利用生物信息學(xué)相關(guān)軟件MUMmer對(duì)Contigs進(jìn)行排列,Glimmer 3.0進(jìn)行開(kāi)放性閱讀框(ORFs)預(yù)測(cè),NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)NR庫(kù)數(shù)據(jù)進(jìn)行功能注釋,得到DLL-E4的CDS功能信息,并且通過(guò)Local Blast對(duì)其中的LTTRs進(jìn)行同種間的比較,試圖從生物信息學(xué)得方法獲得pnpA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。從已經(jīng)報(bào)道pnp基因簇中的LTTRs進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)P.putida DLL-E4基因組中的OPR_3566與多個(gè)PNP降解菌株的調(diào)控因子氨基酸序列同源性較高。對(duì)菌株DLL-E4和DLL-AR中的OPR_3566進(jìn)行單交換插入失活,結(jié)果表明ORF_3566缺失菌株降解PNP降解性狀喪失。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析,在PNP誘導(dǎo)后的菌株中ORF_3566會(huì)出現(xiàn)明顯表達(dá)。因此該ORF_3566可能為pnpAB的調(diào)控基因pnpABR目前對(duì)于pnpR作用于兩套HQ代謝基因簇的調(diào)控尚不明確,本研究對(duì)DLL-AR中pnpC1、pnpC1b基因通過(guò)同源重組的方法進(jìn)行沉默,獲得突變菌株DLL-dpnpC1、DLL-dpnpC1b。結(jié)果表明兩個(gè)突變株菌均不能有效降解HQ,只能部分轉(zhuǎn)化,從DLL/AR-dpnpC1、DLL/△R-dpnpC1b的降解狀況基本相同可以認(rèn)為,當(dāng)其中一個(gè)基因沉默后另第一套的pnpC1行使功能,即可認(rèn)為兩套HQ代謝基因簇均行使功能。
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：X172;Q78

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1326591