本文關(guān)鍵詞：微囊藻毒素-LR對HepG2細(xì)胞腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的影響

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【摘要】：微囊藻毒素(microcytstins,MCs)是由藍(lán)藻產(chǎn)生的且具有肝毒性的小肽內(nèi)毒素,可誘發(fā)肝炎并促發(fā)肝癌,對易感人群健康存在極大威脅。本實驗通過研究MCs對人肝癌細(xì)胞HepG2肝癌相關(guān)的原癌基因及抑癌基因表達(dá)的影響,探討該毒素誘導(dǎo)肝炎/肝癌的機(jī)理,為毒素暴露人群健康的防護(hù)提供理論支撐。本研究采用常規(guī)細(xì)胞毒性實驗方法,用純毒素MC-LR對HepG2細(xì)胞進(jìn)行染毒處理,MTT法檢測細(xì)胞活力,以確定該毒素的細(xì)胞毒性。根據(jù)細(xì)胞毒性及其細(xì)胞活力實驗結(jié)果,我們選擇MC-LR的非細(xì)胞毒染毒濃度為0 n M、10 n M、50 n M、0.5μM、10μM、50μM;染毒時間分別為8 h、24 h、48 h和72 h。細(xì)胞染毒處理結(jié)束后,收集HepG2細(xì)胞、提取總RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR;然后用q PCR檢測與肝癌相關(guān)的原癌基因c-Met、c-fos、c-jun、c-myc、N-ras及抑癌基因PTEN轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況。同時,采用Western blot方法檢測上述基因蛋白水平的表達(dá)。本研究所獲得的主要實驗結(jié)果有如下3個方面。1.MTT檢測結(jié)果和MC-LR的細(xì)胞毒性用MC-LR處理HepG2細(xì)胞8 h、24 h時,MTT檢測發(fā)現(xiàn),染毒組和對照組之間對比發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活力無統(tǒng)計學(xué)差異。處理48 h時(除100μM組)染毒組細(xì)胞活性雖有所降低,但與對照組相比仍無明顯差別。僅100μM MC-LR暴露48 h后,細(xì)胞活力與對照組相比顯著下降。2.MC-LR對HepG2細(xì)胞原癌基因及抑癌基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的影響HepG2細(xì)胞經(jīng)MC-LR染毒處理后,qPCR檢測發(fā)現(xiàn),原癌基因c-Met的相對表達(dá)量(m RNA水平)隨MC-LR處理劑量的增加及處理時間的延長而顯著上升,且高濃度組較低濃度組上升更明顯。該實驗結(jié)果說明,MC-LR染毒明顯促進(jìn)HepG2細(xì)胞中原癌基因c-Met的表達(dá)。原癌基因c-fos轉(zhuǎn)錄水平經(jīng)MC-LR染毒8 h時即明顯上調(diào),且均達(dá)到最高峰。染毒24 h、48 h和72 h時,上調(diào)情況有所下降。因此,MC-LR染毒也明顯促進(jìn)HepG2細(xì)胞原癌基因c-fos的表達(dá),而且染毒濃度越高,促進(jìn)作用越明顯。原癌基因c-jun的mRNA水平在MC-LR處理8 h時,各濃度組和對照組相比均顯著上升,并且隨著染毒劑量的加大而升高。處理24 h時持續(xù)上調(diào)但高濃度組相對于低濃度組升高更為明顯,且各染毒組均上調(diào)到最高峰。48 h和72 h各濃度組仍然上調(diào),但上調(diào)幅度下降。該實驗結(jié)果說明,MC-LR染毒明顯促進(jìn)HepG2細(xì)胞中原癌基因c-jun的表達(dá)。MC-LR染毒8 h時,各濃度組細(xì)胞c-myc的轉(zhuǎn)錄水平均較對照組升高并達(dá)到最高峰。24 h、48 h和72 h時各濃度組c-myc表達(dá)仍顯著上升,但相對于8 h情況有所下降。因此,c-myc的表達(dá)隨著MC-LR暴露濃度的增加而顯著上調(diào)。和對照組相比,各濃度MC-LR組(除10 n M組)HepG2細(xì)胞N-ras的表達(dá)經(jīng)染毒8 h均顯著上調(diào)。24 h時繼續(xù)上調(diào),48 h上調(diào)達(dá)到最高峰,72 h上調(diào)情況有所下降,且隨染毒濃度增加而加強(qiáng)。該實驗結(jié)果表明,MC-LR染毒明顯促進(jìn)HepG2細(xì)胞中原癌基因N-ras的表達(dá)。MC-LR染毒后,HepG2細(xì)胞抑癌基因PTEN的表達(dá)情況比較復(fù)雜。處理8 h和24 h比對照組明顯下調(diào),且高濃度組下調(diào)情況比低濃度組更為顯著。48 h時仍顯著下調(diào),且0.5μM組、10μM組及50μM組下調(diào)達(dá)到最低水平。72 h時50 n M組、0.5μM組、10μM組及50μM組,表達(dá)均顯著下調(diào)。該檢測結(jié)果表明,MC-LR染毒明顯抑制PTEN的表達(dá)。3.MC-LR對HepG2細(xì)胞中原癌基因及抑癌基因蛋白表達(dá)水平的影響Western blot檢測結(jié)果表明,MC-LR染毒處理上調(diào)原癌基因c-Met、c-Fos、c-Jun、c-Myc及N-Ras的蛋白水平,但下調(diào)PTEN的蛋白水平。該結(jié)果與MC-LR對其轉(zhuǎn)錄的影響結(jié)果一致。本實驗結(jié)果說明,采用非細(xì)胞毒濃度的MC-LR染毒HepG2細(xì)胞后,極低劑量的MC-LR能分別于轉(zhuǎn)錄及蛋白水平上調(diào)原癌基因表達(dá)且下調(diào)抑癌基因表達(dá)。該結(jié)果不僅說明HepG2細(xì)胞肝癌相關(guān)原癌基因及抑癌基因與MC-LR肝細(xì)胞毒性密切相關(guān),而且在基因表達(dá)水平說明MC-LR引發(fā)肝炎/肝癌可能與該毒素誘導(dǎo)的原癌基因過表達(dá)及抑癌基因的表達(dá)抑制存在緊密聯(lián)系。本研究結(jié)果對于揭示MC-LR所致肝炎/肝癌的機(jī)理及保護(hù)毒素暴露人群的健康具有一定的理論意義。
【學(xué)位授予單位】：河南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：X52;R730.2

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本文編號：1229692