本文關鍵詞：解烴菌TY22的解烴特性及其烷烴羥化酶基因的克隆

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【摘要】：石油是目前全世界最為重要的能源物質,但在其開發(fā)和使用過程中,往往會泄漏或排放出大量石油烴污染物而造成嚴重的環(huán)境污染。隨著污染情況日益加劇,高效且不產(chǎn)生二次污染的石油烴微生物修復技術現(xiàn)已成為該領域研究的熱點,烷烴羥化酶作為啟動整個降解過程的關鍵酶,也成為了研究的焦點。本研究以從南充煉油廠周圍被石油污染的土壤中篩選出的一株高效石油烴降解菌TY22為研究對象,經(jīng)鑒定,該菌株歸屬于Acinetobacter beijerinckii,最適生長溫度和pH分別為30℃、7.0,能降解C12~C32的正構烷烴。由于微生物的生長和代謝與環(huán)境中的金屬離子密切相關,本文研究了15種金屬離子對TY22烷烴降解的影響。結果表明,低濃度的Na~+、Mg~(2+)、K~+、Mn~(2+)、Ca~(2+)、Co~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)對TY22菌株的生長和烷烴降解有一定的促進作用,但Ca~(2+)、Co~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)的促進作用較小,且當它們超過最適濃度后,菌體生物量快速減少;Fe~(3+)、Ti~(4+)對TY22菌株的生長和烷烴降解有一定的抑制作用,但低濃度的Fe~(3+)對其影響不大,且當它們的濃度達到1 mmol/L時,菌株仍具有一定的生長潛力;Al~(3+)、Pb~(2+)對TY22菌株的生長和烷烴降解有很強的抑制作用,當其濃度達到0.8mmol/L時,菌體生物量已下降至0.1以下;Ba~(2+)、Ag~+、Ni~(2+)對TY22菌株的生長和烷烴降解有極強的抑制作用,當它們的濃度達到0.1 mmol/L(Ba~(2+)達到0.4mmol/L)時,菌體生物量幾乎為零。本文還研究了TY22菌株的烷烴羥化酶基因alkB。以TY22基因組DNA為模板,PCR擴增得到了TY22菌株烷烴羥化酶基因的部分序列。再通過染色體步移(Chromosome Walking)技術,最終獲得了1236 bp的烷烴羥化酶基因完整CDS序列(GenBank Accession:KU867870)。經(jīng)分析,該基因編碼一段411 aa的蛋白,相對分子量46.7 kDa,等電點9.22。BLAST比對后發(fā)現(xiàn),該序列與多株Acinetobacter beijerinckii的烷烴羥化酶氨基酸序列存在極高的同源性,最高可達99%。預測其二級結構包括37.47%的α螺旋,10.71%的β轉角,35.28%的無規(guī)則卷曲和16.55%的延伸鏈。進一步將TY22的alkB基因與pET21b(+)載體構建重組質粒,并轉入E.coli BL21(DE3)進行表達。結果發(fā)現(xiàn),重組菌在0.1 mM IPTG、30℃條件下誘導培養(yǎng)6h的表達效果最佳,所得的46 kDa蛋白也與預期理論值相符。再將alkB基因克隆至pCom8載體中,并分別轉入E.coli GEc137(pGEc47△B)和Pseudomonas fluorescens KOB2Δ1進行基因功能的互補試驗。結果發(fā)現(xiàn),TY22菌株的烷烴羥化酶能氧化C12~C16的中長鏈烷烴。
【關鍵詞】：石油烴降解菌 金屬離子 烷烴羥化酶 表達 功能互補
【學位授予單位】：西華師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：X172;Q78
【目錄】：

• 摘要7-8
• Abstract8-10
• 主要符號對照表10-11
• 第一章 前言11-18
• 1.1 石油污染物11-12
• 1.1.1 石油的組成11
• 1.1.2 石油污染物的危害11-12
• 1.2 石油污染的微生物修復12-13
• 1.2.1 石油烴降解菌的種類12-13
• 1.2.2 微生物降解石油烴的代謝途徑和機理13
• 1.2.3 環(huán)境條件對微生物修復的影響13
• 1.3 烷烴羥化酶研究進展13-16
• 1.4 烷烴羥化酶的應用16-17
• 1.5 本研究的內容、目的及意義17-18
• 第二章 不同金屬離子對解烴菌TY22烷烴降解的影響18-28
• 2.1 實驗材料18-19
• 2.1.1 菌株18
• 2.1.2 主要試劑18
• 2.1.3 培養(yǎng)基18
• 2.1.4 常用溶液18-19
• 2.1.5 主要儀器設備19
• 2.2 實驗方法19-20
• 2.2.1 菌種的活化與純化19
• 2.2.2 降解實驗19
• 2.2.3 菌體生物量的測定19-20
• 2.3 結果與分析20-27
• 2.3.1 輕金屬離子對解烴菌TY22烷烴降解的影響20-23
• 2.3.2 重金屬離子對解烴菌TY22烷烴降解的影響23-27
• 2.4 本章小結27-28
• 第三章 烷烴羥化酶基因alkB的克隆及序列分析28-47
• 3.1 實驗材料28-29
• 3.1.1 菌株與載體28
• 3.1.2 主要試劑28
• 3.1.3 培養(yǎng)基28
• 3.1.4 常用溶液28-29
• 3.1.5 主要儀器設備29
• 3.2 烷烴羥化酶基因alkB片段的克隆29-38
• 3.2.1 引物29-30
• 3.2.2 實驗方法30-33
• 3.2.3 結果與分析33-38
• 3.3 染色體步移技術測定烷烴羥化酶基因alkB全序列38-41
• 3.3.1 實驗方法38-40
• 3.3.2 結果與分析40-41
• 3.4 序列分析41-45
• 3.4.1 DNA序列BLAST分析41-42
• 3.4.2 氨基酸序列BLAST分析42-43
• 3.4.3 蛋白理化性質分析43
• 3.4.4 蛋白二級結構、三級結構的預測43-45
• 3.5 本章小結45-47
• 第四章 烷烴羥化酶基因alkB在大腸桿菌中誘導表達47-57
• 4.1 實驗材料47-48
• 4.1.1 菌株與質粒47
• 4.1.2 主要試劑47
• 4.1.3 培養(yǎng)基47
• 4.1.4 常用溶液47-48
• 4.1.5 主要儀器設備48
• 4.2 實驗方法48-52
• 4.2.1 聚合酶鏈式反應（PCR）48-49
• 4.2.2 重組菌的構建49-51
• 4.2.3 重組菌的誘導表達51-52
• 4.3 結果與分析52-56
• 4.3.1 alkB基因的PCR擴增52-53
• 4.3.2 陽性克隆的鑒定53-54
• 4.3.3 重組菌的誘導表達54-56
• 4.4 本章小結56-57
• 第五章 烷烴羥化酶基因alkB的缺失與互補功能驗證57-66
• 5.1 實驗材料57-59
• 5.1.1 菌株57
• 5.1.2 質粒57
• 5.1.3 主要試劑57-58
• 5.1.4 培養(yǎng)基及常用溶液58
• 5.1.5 主要儀器設備58-59
• 5.2 實驗方法59-62
• 5.2.1 聚合酶鏈式反應（PCR）59
• 5.2.2 重組菌的構建59-62
• 5.2.3 重組菌的功能互補實驗62
• 5.3 結果與分析62-65
• 5.3.1 alkB基因的PCR擴增62-63
• 5.3.2 陽性克隆的鑒定63-64
• 5.3.3 重組菌的功能互補實驗64-65
• 5.4 本章小結65-66
• 第六章 結論與展望66-68
• 6.1 結論66-67
• 6.2 展望67-68
• 參考文獻68-74
• 附錄 A pet21 系列載體圖譜及相關序列位點74-75
• 致謝75-78
• 在學期間的科研情況78

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1 陳暉,韓輝,徐冠珠;擴環(huán)酶的研究進展及其應用前景[J];生物工程進展;2000年01期

2 鐘雁,閔f，

本文編號：1050338