本文關(guān)鍵詞：解烴菌TY22的解烴特性及其烷烴羥化酶基因的克隆

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【摘要】：石油是目前全世界最為重要的能源物質(zhì),但在其開發(fā)和使用過程中,往往會(huì)泄漏或排放出大量石油烴污染物而造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。隨著污染情況日益加劇,高效且不產(chǎn)生二次污染的石油烴微生物修復(fù)技術(shù)現(xiàn)已成為該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn),烷烴羥化酶作為啟動(dòng)整個(gè)降解過程的關(guān)鍵酶,也成為了研究的焦點(diǎn)。本研究以從南充煉油廠周圍被石油污染的土壤中篩選出的一株高效石油烴降解菌TY22為研究對(duì)象,經(jīng)鑒定,該菌株歸屬于Acinetobacter beijerinckii,最適生長溫度和pH分別為30℃、7.0,能降解C12~C32的正構(gòu)烷烴。由于微生物的生長和代謝與環(huán)境中的金屬離子密切相關(guān),本文研究了15種金屬離子對(duì)TY22烷烴降解的影響。結(jié)果表明,低濃度的Na~+、Mg~(2+)、K~+、Mn~(2+)、Ca~(2+)、Co~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)對(duì)TY22菌株的生長和烷烴降解有一定的促進(jìn)作用,但Ca~(2+)、Co~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)的促進(jìn)作用較小,且當(dāng)它們超過最適濃度后,菌體生物量快速減少;Fe~(3+)、Ti~(4+)對(duì)TY22菌株的生長和烷烴降解有一定的抑制作用,但低濃度的Fe~(3+)對(duì)其影響不大,且當(dāng)它們的濃度達(dá)到1 mmol/L時(shí),菌株仍具有一定的生長潛力;Al~(3+)、Pb~(2+)對(duì)TY22菌株的生長和烷烴降解有很強(qiáng)的抑制作用,當(dāng)其濃度達(dá)到0.8mmol/L時(shí),菌體生物量已下降至0.1以下;Ba~(2+)、Ag~+、Ni~(2+)對(duì)TY22菌株的生長和烷烴降解有極強(qiáng)的抑制作用,當(dāng)它們的濃度達(dá)到0.1 mmol/L(Ba~(2+)達(dá)到0.4mmol/L)時(shí),菌體生物量幾乎為零。本文還研究了TY22菌株的烷烴羥化酶基因alkB。以TY22基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增得到了TY22菌株烷烴羥化酶基因的部分序列。再通過染色體步移(Chromosome Walking)技術(shù),最終獲得了1236 bp的烷烴羥化酶基因完整CDS序列(GenBank Accession:KU867870)。經(jīng)分析,該基因編碼一段411 aa的蛋白,相對(duì)分子量46.7 kDa,等電點(diǎn)9.22。BLAST比對(duì)后發(fā)現(xiàn),該序列與多株Acinetobacter beijerinckii的烷烴羥化酶氨基酸序列存在極高的同源性,最高可達(dá)99%。預(yù)測其二級(jí)結(jié)構(gòu)包括37.47%的α螺旋,10.71%的β轉(zhuǎn)角,35.28%的無規(guī)則卷曲和16.55%的延伸鏈。進(jìn)一步將TY22的alkB基因與pET21b(+)載體構(gòu)建重組質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3)進(jìn)行表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),重組菌在0.1 mM IPTG、30℃條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)6h的表達(dá)效果最佳,所得的46 kDa蛋白也與預(yù)期理論值相符。再將alkB基因克隆至pCom8載體中,并分別轉(zhuǎn)入E.coli GEc137(pGEc47△B)和Pseudomonas fluorescens KOB2Δ1進(jìn)行基因功能的互補(bǔ)試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),TY22菌株的烷烴羥化酶能氧化C12~C16的中長鏈烷烴。
【關(guān)鍵詞】：石油烴降解菌 金屬離子 烷烴羥化酶 表達(dá) 功能互補(bǔ)
【學(xué)位授予單位】：西華師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：X172;Q78
【目錄】：

• 摘要7-8
• Abstract8-10
• 主要符號(hào)對(duì)照表10-11
• 第一章 前言11-18
• 1.1 石油污染物11-12
• 1.1.1 石油的組成11
• 1.1.2 石油污染物的危害11-12
• 1.2 石油污染的微生物修復(fù)12-13
• 1.2.1 石油烴降解菌的種類12-13
• 1.2.2 微生物降解石油烴的代謝途徑和機(jī)理13
• 1.2.3 環(huán)境條件對(duì)微生物修復(fù)的影響13
• 1.3 烷烴羥化酶研究進(jìn)展13-16
• 1.4 烷烴羥化酶的應(yīng)用16-17
• 1.5 本研究的內(nèi)容、目的及意義17-18
• 第二章 不同金屬離子對(duì)解烴菌TY22烷烴降解的影響18-28
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料18-19
• 2.1.1 菌株18
• 2.1.2 主要試劑18
• 2.1.3 培養(yǎng)基18
• 2.1.4 常用溶液18-19
• 2.1.5 主要儀器設(shè)備19
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法19-20
• 2.2.1 菌種的活化與純化19
• 2.2.2 降解實(shí)驗(yàn)19
• 2.2.3 菌體生物量的測定19-20
• 2.3 結(jié)果與分析20-27
• 2.3.1 輕金屬離子對(duì)解烴菌TY22烷烴降解的影響20-23
• 2.3.2 重金屬離子對(duì)解烴菌TY22烷烴降解的影響23-27
• 2.4 本章小結(jié)27-28
• 第三章 烷烴羥化酶基因alkB的克隆及序列分析28-47
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料28-29
• 3.1.1 菌株與載體28
• 3.1.2 主要試劑28
• 3.1.3 培養(yǎng)基28
• 3.1.4 常用溶液28-29
• 3.1.5 主要儀器設(shè)備29
• 3.2 烷烴羥化酶基因alkB片段的克隆29-38
• 3.2.1 引物29-30
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)方法30-33
• 3.2.3 結(jié)果與分析33-38
• 3.3 染色體步移技術(shù)測定烷烴羥化酶基因alkB全序列38-41
• 3.3.1 實(shí)驗(yàn)方法38-40
• 3.3.2 結(jié)果與分析40-41
• 3.4 序列分析41-45
• 3.4.1 DNA序列BLAST分析41-42
• 3.4.2 氨基酸序列BLAST分析42-43
• 3.4.3 蛋白理化性質(zhì)分析43
• 3.4.4 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測43-45
• 3.5 本章小結(jié)45-47
• 第四章 烷烴羥化酶基因alkB在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)47-57
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料47-48
• 4.1.1 菌株與質(zhì)粒47
• 4.1.2 主要試劑47
• 4.1.3 培養(yǎng)基47
• 4.1.4 常用溶液47-48
• 4.1.5 主要儀器設(shè)備48
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法48-52
• 4.2.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）48-49
• 4.2.2 重組菌的構(gòu)建49-51
• 4.2.3 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)51-52
• 4.3 結(jié)果與分析52-56
• 4.3.1 alkB基因的PCR擴(kuò)增52-53
• 4.3.2 陽性克隆的鑒定53-54
• 4.3.3 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)54-56
• 4.4 本章小結(jié)56-57
• 第五章 烷烴羥化酶基因alkB的缺失與互補(bǔ)功能驗(yàn)證57-66
• 5.1 實(shí)驗(yàn)材料57-59
• 5.1.1 菌株57
• 5.1.2 質(zhì)粒57
• 5.1.3 主要試劑57-58
• 5.1.4 培養(yǎng)基及常用溶液58
• 5.1.5 主要儀器設(shè)備58-59
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法59-62
• 5.2.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）59
• 5.2.2 重組菌的構(gòu)建59-62
• 5.2.3 重組菌的功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)62
• 5.3 結(jié)果與分析62-65
• 5.3.1 alkB基因的PCR擴(kuò)增62-63
• 5.3.2 陽性克隆的鑒定63-64
• 5.3.3 重組菌的功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)64-65
• 5.4 本章小結(jié)65-66
• 第六章 結(jié)論與展望66-68
• 6.1 結(jié)論66-67
• 6.2 展望67-68
• 參考文獻(xiàn)68-74
• 附錄 A pet21 系列載體圖譜及相關(guān)序列位點(diǎn)74-75
• 致謝75-78
• 在學(xué)期間的科研情況78

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中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 陳暉,韓輝,徐冠珠;擴(kuò)環(huán)酶的研究進(jìn)展及其應(yīng)用前景[J];生物工程進(jìn)展;2000年01期

2 鐘雁,閔f，

本文編號(hào)：1050338