本文關(guān)鍵詞：靶向抑制小鼠骨組織miR-132-3p表達對模擬失重所致骨質(zhì)丟失的干預(yù)研究

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【摘要】：航天飛行中,失重環(huán)境打破了人體長期適應(yīng)地面正常重力環(huán)境而建立起來的機體穩(wěn)態(tài)平衡,造成多個系統(tǒng)功能紊亂,嚴重影響著航天員的健康和在軌作業(yè)能力。其中,失重性骨質(zhì)丟失的持續(xù)發(fā)生會導(dǎo)致航天員體內(nèi)負鈣平衡、骨折以及腎結(jié)石患病風險顯著增加,并對骨骼造成不可逆損傷,業(yè)已成為阻礙人類進行中長期航天飛行的三大醫(yī)學(xué)難題之一。因此,探尋有效的失重性骨質(zhì)丟失防護措施一直是航天醫(yī)學(xué)研究的重點和焦點問題。在50多年的載人航天飛行實踐中,航天醫(yī)學(xué)工作者已經(jīng)從物理干預(yù)、藥物治療、生活作息和飲食結(jié)構(gòu)等方面進行了大量的研究,但還未能夠有效解決失重性骨質(zhì)丟失的防護問題。美、俄等航天大國認為,必須在基于對失重生物學(xué)效應(yīng)細胞、分子變化本質(zhì)認識的基礎(chǔ)上,闡明重力信號響應(yīng)機制,才能發(fā)展有效的、針對性強的防護措施。已有基因組學(xué)研究證實,在航天飛行和地面模擬失重條件下,成骨細胞中上百種基因表達會出現(xiàn)顯著變化,而miRNA作為基因表達轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控因子在其中所起的作用不容忽視。隨著航天醫(yī)學(xué)在細胞分子水平研究的不斷深入,航天醫(yī)學(xué)工作者也逐漸認識到miRNA在調(diào)控失重生物學(xué)效應(yīng)方面所起的重要作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn),模擬失重導(dǎo)致大鼠股骨組織內(nèi)mir-132-3p表達顯著升高,而體外過表達mir-132-3p可以抑制大鼠原代成骨細胞的增殖、分化和礦化能力,降低mir-132-3p表達則促進成骨細胞上述功能,提示其可能在模擬失重導(dǎo)致的骨質(zhì)丟失中發(fā)揮重要調(diào)控作用�；谝陨辖Y(jié)果,我們進一步研究了mir-132-3p對成骨細胞的來源細胞bmsc成骨分化能力的影響,并在回轉(zhuǎn)器模擬的失重環(huán)境下,初步檢驗了干預(yù)mir-132-3p表達對模擬失重所致bmsc成骨分化能力減弱的防護效果;之后,借助于分子靶向技術(shù)和基因修飾技術(shù),通過尾靜脈注射將包裹有mir-132-3p抑制劑“antagomir-132”的骨組織靶向輸送系統(tǒng)“(aspserser)6-脂質(zhì)體”注入到尾吊小鼠體內(nèi),特異性抑制尾吊小鼠骨組織中mir-132-3p的表達,嘗試采用體內(nèi)沉默mirna表達來防護失重性骨質(zhì)丟失的發(fā)生發(fā)展。本研究的主要發(fā)現(xiàn)和結(jié)果如下:1、mir-132-3p對小鼠bmsc成骨分化具有抑制作用。骨形成部位是bmsc向成骨細胞分化過程中的系列成骨樣和成骨細胞集合區(qū)。為開展特異性靶向骨形成表面輸送mir-132-3p的抑制劑來降低骨組織中mir-132-3p的表達而實施失重性骨質(zhì)丟失的對抗治療,我們首先研究確認了mir-132-3p對小鼠bmsc成骨分化的調(diào)控作用。小鼠原代bmsc經(jīng)分離培養(yǎng)后,在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基的誘導(dǎo)下,細胞中成骨細胞分化標志物runx2、osx的基因和蛋白表達以及alp的基因和蛋白活性均顯著增高,同時細胞外基質(zhì)礦化結(jié)節(jié)增多,表明分離所得bmsc在體外具有良好的成骨細胞方向分化能力。在bmsc成骨誘導(dǎo)分化過程中,qrt-pcr檢測到mir-132-3p表達逐漸降低,此時通過轉(zhuǎn)染mir-132-3p的mimic可提高bmsc中mir-132-3p的表達,阻礙bmsc向成骨細胞分化以及細胞外基質(zhì)的礦化過程;而轉(zhuǎn)染mir-132-3p的inhibitor降低bmsc中mir-132-3p的表達則對bmsc向成骨細胞分化以及其細胞外基質(zhì)礦化過程具有促進作用。上述結(jié)果提示,mir-132-3p的靶基因可能是bmsc成骨分化信號通路中的關(guān)鍵基因之一,干預(yù)mir-132-3p的表達可增強或抑制成骨分化信號通路。2、抑制mir-132-3p表達可對抗回轉(zhuǎn)模擬失重導(dǎo)致的bmsc成骨分化能力降低。經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)的第三代bmsc,在回轉(zhuǎn)器模擬失重72h的培養(yǎng)過程中,bmsc成骨分化標志物runx2、osx、alp的表達逐漸降低,表明模擬失重下bmsc的成骨分化過程受到抑制。在此過程中,mir-132-3p的表達隨模擬失重暴露時間的延長而逐漸升高,表明模擬失重可以促進BMSC中miR-132-3p的表達。運用化學(xué)方法合成mi R-132-3p的互補鏈,并轉(zhuǎn)染到BMSC中降低內(nèi)源性miR-132-3p表達,再次暴露于模擬失重環(huán)境,可以顯著促進成骨細胞分化標志物Runx2和Osx基因及蛋白的表達,并顯著促進ALP的基因表達和蛋白活性,有效對抗模擬失重導(dǎo)致的BMSC成骨分化能力降低。3、靶向抑制尾吊小鼠骨組織中miR-132-3p表達可以有效防護失重性骨質(zhì)丟失的發(fā)生。小鼠尾吊模擬失重實驗中,我們通過骨組織靶向輸送系統(tǒng)“(AspSerSer)6-脂質(zhì)體”將miR-132-3p抑制劑“antagomir-132”靶向輸送至骨形成表面。qRT-PCR檢測顯示,實驗鼠骨組織中miR-132-3p的表達顯著降低,而心、肝、腎、肺等其他主要組織中miR-132-3p的表達無顯著變化,證實該靶向系統(tǒng)可以特異性地將miR-132-3p抑制劑輸送至骨組織中;隨后,我們進一步檢測了降低骨組織中miR-132-3p表達對骨組織形態(tài)學(xué)、組織化學(xué)、骨組織微觀結(jié)構(gòu)及力學(xué)性能的影響。結(jié)果顯示,與尾吊陰性對照組相比,尾吊實驗組骨組織中成骨細胞分化標志物Runx2、Osx、ALP和COL-Ⅰ的基因表達顯著增高,新生骨形成增多,而且骨小梁微觀結(jié)構(gòu)及骨骼力學(xué)性能得到顯著改善,提示靶向抑制骨組織miR-132-3p表達可以有效緩解模擬失重引起的骨質(zhì)丟失。綜上所述,我們分別研究了正常環(huán)境和模擬失重環(huán)境下miR-132-3p對小鼠BMSC成骨分化能力的影響,并靶向抑制尾吊小鼠骨組織中miR-132-3p表達,觀察了干預(yù)體內(nèi)miR-132-3p表達對失重性骨質(zhì)丟失的防護作用。我們發(fā)現(xiàn)miR-132-3p對小鼠BMSC成骨分化具有抑制作用,靶向抑制尾吊小鼠骨組織中miR-132-3p表達可有效減緩失重性骨質(zhì)丟失的發(fā)生,這些結(jié)果為進一步闡明失重性骨質(zhì)丟失發(fā)生發(fā)展的細胞學(xué)機制并開發(fā)新型防護手段提供了理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：模擬失重 尾吊模型 miRNA miR-132-3p 骨形成 靶向 骨髓間充質(zhì)干細胞
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R852.22
【目錄】：

• 縮略語表4-9
• 中文摘要9-12
• 引文摘要12-16
• 前言16-17
• 文獻回顧17-41
• 第一部分 miR1323p對小鼠BMSC成骨分化的影響41-60
• 1 材料41-45
• 2 方法45-52
• 3 結(jié)果52-58
• 4 討論58-60
• 第二部分 抑制miR1323p表達對回轉(zhuǎn)所致BMSC成骨分化能力減弱的防護研究60-68
• 1 材料60-61
• 2 方法61-62
• 3 結(jié)果62-66
• 4 討論66-68
• 第三部分 靶向抑制骨組織miR1323p表達對模擬失重所致骨質(zhì)丟失的干預(yù)研究68-84
• 1 材料69-70
• 2 方法70-74
• 3 結(jié)果74-82
• 4 討論82-84
• 小結(jié)84-85
• 參考文獻85-105
• 個人簡歷和研究成果105-106
• 致謝106-107

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本文編號：1116761