【摘要】：抗生素濫用導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥性已成為威脅人類健康和安全的重大問題,新型抗菌劑的開發(fā)和應(yīng)用成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。銀納米顆粒(Silver nanoparticles,AgNPs)因具有廣譜、高效、低耐藥的抗菌特性,良好的生物相容性以及耐熱加工的合成特點(diǎn)而備受青睞。但是銀納米顆粒的易團(tuán)聚、易被氧化和易解離等缺點(diǎn)極大地限制了它在生物醫(yī)學(xué)、紡織、水處理和涂料等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。為了克服銀納米顆粒的缺點(diǎn),本論文設(shè)計(jì)和制備了兩種新型銀基納米復(fù)合材料,分別為氧化石墨烯-納米銀復(fù)合物(Graphene oxide-silver nanoparticles,GO-AgNPs)和Y型DNA-銀納米簇復(fù)合物(Y-DNA-silver nanoclusters,Y-AgNCs),并系統(tǒng)研究了它們的物理化學(xué)性質(zhì)、抗菌性、生物相容性以及在傷口愈合中的應(yīng)用。主要研究?jī)?nèi)容及成果概述如下:(1)GO-AgNPs復(fù)合材料和GO-AgNPs基底的制備與表征。我們采用改良的Hummers方法,制備出水分散性良好的氧化石墨烯(GO)懸液,原子力顯微成像顯示GO為單片層,厚度約1 nm,大小為幾百納米到3μm之間。然后,我們以硼氫化鈉為還原劑,通過原位化學(xué)還原法合成GO-AgNPs,透射電鏡顯微成像顯示GO-AgNPs中AgNPs的平均粒徑為7.06±2.54 nm。最后,我們采用滴涂法在玻璃表面修飾一層GO-AgNPs薄膜。通過調(diào)節(jié)GO-AgNPs濃度,得到表面GO-AgNPs吸附量不同的系列玻璃基底。(2)氧化石墨烯-納米銀復(fù)合物對(duì)菌膜形成和結(jié)構(gòu)的調(diào)控。我們選擇綠膿桿菌作為研究對(duì)象,研究了GO-AgNPs懸液對(duì)菌膜生長(zhǎng)和結(jié)構(gòu)的影響。在12 h內(nèi),GO-AgNPs懸液對(duì)綠膿桿菌菌膜形成的抑制效應(yīng)具有濃度依賴性:GO-AgNPs懸液的濃度越高,菌膜越難形成;濃度為25μg/mL時(shí),GO-AgNPs懸液會(huì)徹底抑制菌膜的形成。而且,GO-AgNPs懸液的抗菌膜效果優(yōu)于單獨(dú)的GO或AgNPs,這種優(yōu)異的抗菌性源自復(fù)合材料兩種組分的協(xié)同作用。此外,GO-AgNPs懸液對(duì)菌膜生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的影響存在一個(gè)臨界值15μg/mL。低于臨界濃度,GO-AgNPs懸液延緩菌膜生長(zhǎng),菌膜生長(zhǎng)24 h到達(dá)成熟期;高于此濃度,GO-AgNPs懸液徹底抑制菌膜形成。同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)低濃度的GO-AgNPs懸液幾乎不影響成熟期菌膜的總生物量,但影響菌膜的結(jié)構(gòu)組成,即顯著降低細(xì)菌增殖卻促進(jìn)細(xì)菌分泌更多的胞外多聚物(Extracellular polymeric substance,EPS)。這些研究成果為調(diào)節(jié)菌膜形成和結(jié)構(gòu)提供了一種簡(jiǎn)單方法,也為防止菌膜誘發(fā)細(xì)菌感染或更好地利用菌膜治理污水等應(yīng)用提供了新思路。(3)氧化石墨烯-納米銀復(fù)合物基底的抗菌膜研究。綠膿桿菌與GO-AgNPs基底共孵育2 h,涂板計(jì)數(shù)顯示GO-AgNPs基底通過殺死細(xì)菌的方式降低粘附于基底的細(xì)菌數(shù)目,進(jìn)而抑制菌膜形成。基底表面GO-AgNPs吸附量直接影響菌膜形成;吸附量越高,菌膜越難形成;當(dāng)GO-AgNPs吸附量達(dá)到20μg/cm~2時(shí),可以有效地防止菌膜生成。同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)GO-AgNPs基底不會(huì)影響小鼠前成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化,也未引發(fā)溶血,顯示了良好的生物相容性。這說明GO-AgNPs可作為臨床植入器件的涂層,防止常規(guī)植入材料易引發(fā)的細(xì)菌感染。(4)Y-AgNCs納米結(jié)構(gòu)及其水凝膠的制備和表征�；贒NA分子的可編程和精確自組裝特性,我們構(gòu)建了富含胞嘧啶(Cytosine,C)環(huán)和粘性末端的Y型DNA納米結(jié)構(gòu)(Y-DNA)。由于銀離子(Ag~+)與C堿基之間的高親和力,我們通過氧化還原法在Y-DNA的C環(huán)處原位合成銀納米簇(Silver nanoclusters,AgNCs),形成Y-AgNCs。UV-Vis光譜顯示Y-AgNCs在408 nm處存在AgNCs的特征紫外吸收峰;熒光分析表明此結(jié)構(gòu)具有紅色熒光,激發(fā)/發(fā)射光波長(zhǎng)分別為565 nm/631 nm。Y-DNA的粘性末端和與其互補(bǔ)的雙鏈DNA交聯(lián)形成DNA-AgNCs水凝膠。流變分析發(fā)現(xiàn)250μM的DNA-AgNCs水凝膠的儲(chǔ)存模量(G’)大于損耗模量(G’’),符合水凝膠的特性。掃描電鏡成像觀察其有典型的水凝膠三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。(5)Y-AgNCs納米結(jié)構(gòu)及其水凝膠的生物效應(yīng)研究。Y-AgNCs對(duì)革蘭氏陰性菌(大腸桿菌Escherichia coli)和陽(yáng)性菌(枯草桿菌Bacillus subtilis)均有很好的抗菌性;其濃度為200 nM時(shí),抗菌率接近100%。此外,Y-AgNCs對(duì)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(NIH-3T3)無明顯的細(xì)胞毒性。在細(xì)菌與細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中,Y-AgNCs依然維持了優(yōu)異的抗菌性和良好的生物相容性。此外,Y-AgNCs能有效促進(jìn)小鼠傷口愈合,可作為潛在的傷口愈合噴霧。DNA-AgNCs水凝膠保持了Y-AgNCs的廣譜抗菌性,可顯著殺滅覆蓋于其表面或包裹在其中的革蘭氏陰性菌和陽(yáng)性菌;當(dāng)Y-AgNCs濃度為200 nM時(shí),水凝膠對(duì)兩種細(xì)菌的抗菌率均接近100%。DNA-AgNCs水凝膠亦可作為細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì),細(xì)胞在水凝膠內(nèi)呈三維空間分布,且生長(zhǎng)良好。因此,DNA-AgNCs水凝膠在組織工程方面顯示出極大的應(yīng)用潛力�？傊�,在本論文中我們制備了兩種新型銀基納米抗菌材料GO-AgNPs和Y-AgNCs,二者均顯示出優(yōu)異的抗菌性和良好的生物相容性,在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。同時(shí),兩種納米復(fù)合材料的研究也拓寬了制備和應(yīng)用銀基納米抗菌材料的思路,為銀基材料更廣泛地使用提供了有價(jià)值的理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1.1 人類利用銀基抗菌材料的歷史[31]。我們知道納米材料的生物效應(yīng)往往與其尺寸相關(guān)，AgNPs 的抗菌性也不例外。 Duran 等[34]的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng) AgNPs 粒徑低于 10 nm 時(shí)，AgNPs 的抗菌活性主要?dú)w因于粒子本身。但隨著 AgNPs 大小逐漸增加時(shí)，抗菌活性主要來自AgNPs 釋放的 Ag+。而且，與銀離子相比，小顆粒的 AgNPs 能夠更容易地進(jìn)入微生物細(xì)胞。AgNPs 通過誘導(dǎo)細(xì)胞膜損傷和活性氧化物（ROS）反應(yīng)，最終破壞細(xì)胞的 DNA，在抗菌上，比銀離子更有優(yōu)勢(shì)[35,36]。除了尺寸大小，AgNPs 的形狀也會(huì)影響 AgNPs 的抗菌活性。Pal 等[37]研究了不同形狀納米銀的抗菌性能，發(fā)現(xiàn)三角形狀的納米銀抗菌性能優(yōu)于棒狀納米銀。此外，Xiu 等[38]發(fā)現(xiàn)在酸性和有氧條件下，AgNPs 能更加快速地釋放銀離子，從而增加抗菌活性。Wirth等[39]發(fā)現(xiàn)帶有 AgNPs 涂層的玻璃表面能有效阻礙綠膿桿菌的著落和增殖。Yoon等[40]發(fā)現(xiàn) AgNPs 對(duì)大腸桿菌的抗菌能力要低于枯草芽孢桿菌，這或許歸因于大

早在十九世紀(jì)，金這種珍貴的金屬被發(fā)現(xiàn)可用于治療梅毒，到 20 世紀(jì)20 年代時(shí)，Aremu 等發(fā)現(xiàn)氰化金可以抑制結(jié)核分歧桿菌[42]。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，人們利用多種方法，如熱分解、多元醇合成法、電化學(xué)合成法和化學(xué)合成法等，成功制備出納米金（AuNPs）。Piruthiviraj 等[43]利用甘藍(lán)合成出 AuNPs，，發(fā)現(xiàn)該 AuNPs 對(duì)革蘭氏陰性菌/陽(yáng)性菌和真菌的抗菌活性高于典型的抗生素氟康唑和慶大霉素（圖 1.2）。Kojic等[44]發(fā)現(xiàn)輻照能增強(qiáng) AuNPs 對(duì)金黃色葡萄球菌的殺滅活性。此外，Guo 等人[45]利用紅外照射 AuNPs 水溶液，發(fā)現(xiàn) AuNPs 能有效破壞溶液中的脂質(zhì)體，間接說明 AuNPs 的抗菌活性可能源自其對(duì)細(xì)胞膜脂質(zhì)體的破壞。此外，除了利用單獨(dú)的 AuNPs 進(jìn)行抗菌，還可以將 AuNPs 與其他抗菌劑（如抗生素和抗菌肽）結(jié)合，實(shí)現(xiàn)協(xié)同增強(qiáng)抗菌。Shaker 等[46]將碳青霉烯（亞胺培南和美羅培南）與檸檬酸鹽覆蓋的 Au 納米顆粒結(jié)合，實(shí)現(xiàn)藥物在 48 小時(shí)內(nèi)的持續(xù)釋放和長(zhǎng)效抗菌。
【學(xué)位授予單位】：上海大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TB33

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本文編號(hào)：2708334