發(fā)布時(shí)間：2020-06-02 11:01

【摘要】：體細(xì)胞重編程生成誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(Induced pluripotent stem cells,iPSCs)的策略因可以避免胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells,ESCs)存在的倫理爭(zhēng)議而備受人們的關(guān)注。然而,iPSCs研究存在的效率低、耗時(shí)長(zhǎng)和安全性差等問(wèn)題限制了其在臨床中的應(yīng)用。鑒于此,本研究采用新型非病毒基因載體——聚乙烯亞胺修飾的超順磁性氧化鐵納米顆粒(Polyethyleneimine coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles,SPION-PEI)介導(dǎo)單個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Oct 4的過(guò)表達(dá),同時(shí)結(jié)合使用小分子物質(zhì)3i即CHIR99021、PD0325901和A-83-01重編程HEK-293T細(xì)胞,旨在建立一種安全性好、生成效率高的iPSCs生成新方法。試驗(yàn)首先通過(guò)細(xì)胞毒性試驗(yàn)篩選出生物相容性良好的SPION-PEI作用濃度,確定SPION-PEI有效結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子Oct 4的攜載量以及SPION-PEI介導(dǎo)Oct 4進(jìn)入HEK-293T細(xì)胞的可能機(jī)制,以便有效提高SPION-PEI攜載Oct 4轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞的效率。然后,通過(guò)G418篩選出EGFP~+細(xì)胞克隆并擴(kuò)增,結(jié)合小分子物質(zhì)3i的處理以逆轉(zhuǎn)化其獲得iPSCs。應(yīng)用該策略生成的iPSCs可以有效避免因病毒載體和致癌基因c-Myc、Klf 4介入而導(dǎo)致的潛在致瘤風(fēng)險(xiǎn),加快iPSCs的臨床應(yīng)用進(jìn)程。試驗(yàn)一:SPION-PEI對(duì)HEK-293T細(xì)胞毒性作用的研究為了篩選生物相容性良好的SPION-PEI的作用濃度,以進(jìn)一步利用其作為非病毒載體有效攜帶轉(zhuǎn)錄因子Oct 4進(jìn)入HEK-293T細(xì)胞過(guò)表達(dá),為iPSCs的生成奠定基礎(chǔ),本研究采用不同濃度(10 ng/μl、50 ng/μl、100 ng/μl、200 ng/μl、400 ng/μl)的SPION或不同濃度(10 ng/μl、50 ng/μl、100 ng/μl、200ng/μl、400ng/μl)的SPION-PEI與HEK-293T細(xì)胞共孵育,通過(guò)比較各處理組細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)形態(tài)變化、存活率、增殖毒性、氧化損傷、DNA損傷等的差異性,探討SPION或SPION-PEI對(duì)HEK-293T細(xì)胞的毒性作用。結(jié)果表明:10 ng/μl的SPION-PEI處理組和10 ng/μl的SPION處理組間差異不顯著(P0.05);其他相同濃度條件下SPION-PEI處理組對(duì)HEK-293T細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)形態(tài)變化影響小于SPION處理組,對(duì)HEK-293T細(xì)胞的存活率、增殖毒性、氧化損傷、DNA損傷均低于SPION處理組。隨著SPION或SPION-PEI處理濃度的增加,對(duì)HEK-293T細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)形態(tài)變化、存活率、增殖毒性、氧化損傷、DNA損傷的影響隨之增加。與對(duì)照組相比,濃度為10 ng/μl、50 ng/μl的SPION-PEI對(duì)HEK-293T細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)形態(tài)變化、存活率、增殖毒性、氧化損傷、DNA損傷的影響差異不顯著(P0.05)。因此,宜在小于50 ng/μl范圍內(nèi)篩選適宜濃度的SPION-PEI攜載Oct 4轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞。試驗(yàn)二:SPION-PEI作為基因載體攜帶Oct 4進(jìn)入HEK-293T細(xì)胞的條件優(yōu)化通過(guò)SPION-PEI與Oct 4結(jié)合效率試驗(yàn)和DNaseⅠ保護(hù)試驗(yàn),探究SPION-PEI對(duì)Oct 4質(zhì)粒DNA的攜載量及其對(duì)抗DNaseⅠ的保護(hù)作用。結(jié)果表明:當(dāng)SPION-PEI與Oct 4質(zhì)粒DNA的質(zhì)量比為1:4時(shí),Oct 4的結(jié)合效率達(dá)到97.13±0.24%,再增加SPION-PEI的量,結(jié)合效率幾乎不再增加,表明該條件下兩者的結(jié)合能力接近飽和;當(dāng)SPION-PEI與Oct 4質(zhì)粒DNA的質(zhì)量比為1:1時(shí),SPION-PEI與Oct 4質(zhì)粒DNA完全結(jié)合,結(jié)合在SPION-PEI上的Oct 4質(zhì)粒DNA,經(jīng)DNaseⅠ消化、DNaseⅠ熱失活、Oct 4洗脫后,瓊脂糖凝膠條帶的亮度與對(duì)照組基本相同,表明其酶切保護(hù)效率接近100%。通過(guò)比較存在外源磁場(chǎng)作用20min的條件下,不同濃度SPION-PEI/Oct4復(fù)合體對(duì)HEK-293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的影響,結(jié)果表明SPION-PEI/Oct4復(fù)合體濃度為1.5 ng/μl時(shí)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率(76.47±2.82%)極顯著高于其余各處理組(P0.01)。為探究SPION-PEI進(jìn)入HEK-293T細(xì)胞的機(jī)制,以尋求進(jìn)一步提高SPION-PEI介導(dǎo)Oct 4轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞效率的可能性,本試驗(yàn)通過(guò)在有外源磁場(chǎng)作用的條件下,比較不同濃度網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞作用抑制劑——氯丙嗪(Chlorpromazin,CPZ;濃度分別為1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml)、小窩蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞作用抑制劑——制霉菌素(Nystatin;濃度分別為5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml)、ATP生成抑制劑——2-脫氧-D-葡萄糖(2-Deoxy-D-Glucose,2-DG;濃度分別為1 mM、5 mM、10 mM、20 mM、40 mM)、巨胞飲作用抑制劑——阿米洛利(Amiloride;濃度分別為0.5 mM、1mM、2mM、4mM、8mM)、巨胞飲作用激活劑——佛波酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA;濃度分別為50nM、100nM、200nM、400nM、800nM)預(yù)處理30min對(duì)SPION-PEI/Oct4復(fù)合體轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞效率的影響。結(jié)果表明:CPZ各濃度處理組和制霉菌素各濃度處理組的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率與對(duì)照組(76.47±2.82%)相比無(wú)顯著性差異(P0.05)。1mM 2-DG處理組的轉(zhuǎn)染效率極顯著低于對(duì)照組(4.63±0.56%vs 76.47±2.82%,P0.01),當(dāng)2-DG的作用濃度為10mM時(shí),轉(zhuǎn)染效率接近于0(0.3±0.58%)。1mM阿米洛利處理組轉(zhuǎn)染效率極顯著低于對(duì)照組(33.8±2.31%vs 76.47±2.82%,P0.01);隨著阿米洛利濃度的增加,轉(zhuǎn)染效率與1mM處理組相比差異不顯著(P0.05)。50nM PMA處理組的轉(zhuǎn)染效率與對(duì)照組比較差異不顯著(76.29±2.04%vs 76.47±2.82%,P0.05);當(dāng)PMA的濃度為100nM、200nM、400nM、800nM時(shí),轉(zhuǎn)染效率顯著高于對(duì)照組(P0.05),其中PMA濃度為100nM時(shí),轉(zhuǎn)染效率最高,達(dá)83.44±2.16%。因此,宜采用SPION-PEI與Oct 4質(zhì)粒DNA的質(zhì)量比為1:1,SPION-PEI/Oct4復(fù)合體濃度為1.5ng/μl,外源磁場(chǎng)作用20min,添加100nM的PMA預(yù)處理30min提高SPION-PEI/Oct4復(fù)合物對(duì)HEK-293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。試驗(yàn)三:SPION-PEI介導(dǎo)Oct 4重編程HEK-293T細(xì)胞為iPSCs的可行性研究為了從基因載體和轉(zhuǎn)錄因子方面提高iPSCs的臨床應(yīng)用安全性,本試驗(yàn)采用非病毒基因載體SPION-PEI介導(dǎo)單個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Oct 4過(guò)表達(dá),同時(shí)聯(lián)合使用小分子物質(zhì)3i(CHIR99021、PD0325901和A-83-01),旨在避免致瘤基因如c-Myc、Klf 4導(dǎo)入的情況下誘導(dǎo)HEK-293T細(xì)胞逆轉(zhuǎn)化生成iPSCs。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、堿性磷酸酶(Alkline phosphatase,AKP)染色、Oct-4和SSEA-3免疫細(xì)胞化學(xué)染色、擬胚體(Embryonic body,EB)生成和分化等指標(biāo)對(duì)其多能性特征進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明:EGFP~+細(xì)胞克隆在使用3i培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)三周后,iPSCs樣集落數(shù)達(dá)到78.23±8.46個(gè);而使用未添加3i的普通干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的EGFP~+細(xì)胞克隆,相同時(shí)間內(nèi)未形成iPSCs樣集落。Oct 4過(guò)表達(dá)結(jié)合小分子物質(zhì)3i作用重編程HEK-293T細(xì)胞所得iPSCs樣集落呈“島嶼”狀,邊界清晰、折光性強(qiáng),高倍鏡下可見(jiàn)細(xì)胞克隆的細(xì)胞核大而細(xì)胞質(zhì)少,細(xì)胞間距非常緊密,形態(tài)上與ESCs相似。所挑選的iPSCs樣集落經(jīng)AKP染色呈紅棕色,Oct-4和SSEA-3免疫細(xì)胞化學(xué)染色均呈紅褐色,為陽(yáng)性反應(yīng)。分離得到的iPSCs樣細(xì)胞懸浮培養(yǎng)5d后形成了簡(jiǎn)單的EB,7d后,形成顯著的有腔EB,將形成的EB移至新的24孔板內(nèi),其貼壁生長(zhǎng)7d后自發(fā)分化為神經(jīng)上皮樣細(xì)胞,EB貼壁分化的細(xì)胞中表達(dá)三個(gè)胚層的標(biāo)志性基因:內(nèi)胚層——甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein,AFP)、中胚層——Brachyury、外胚層——α-1-抗胰蛋白酶(Alpha-1-antitrypsin,AAT)。表明所得iPSCs樣細(xì)胞集落表現(xiàn)出一定的多能干細(xì)胞特性。因此,SPION-PEI介導(dǎo)單個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Oct 4過(guò)表達(dá),同時(shí)聯(lián)合使用小分子物質(zhì)3i的作用可以重編程HEK-293T細(xì)胞成為具有一定多能性特征的iPSCs。結(jié)論:50 ng/μl以下濃度SPION-PEI對(duì)HEK-293T細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用,在SPION-PEI與Oct 4質(zhì)粒DNA的質(zhì)量比為1:1,SPION-PEI/Oct4復(fù)合體濃度為1.5 ng/μl,外源磁場(chǎng)作用20min,添加100nM的PMA預(yù)處理30min的條件下進(jìn)行HEK-293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果較好。SPION-PEI介導(dǎo)單個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Oct 4在HEK-293T細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá),同時(shí)聯(lián)合使用小分子物質(zhì)CHIR99021、PD0325901和A-83-01,可以重編程HEK-293T細(xì)胞成為具有一定多能性特征的iPSCs。應(yīng)用磁性納米技術(shù)介導(dǎo)單個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Oct 4過(guò)表達(dá)結(jié)合使用小分子物質(zhì)重編程生成iPSCs的途徑將為進(jìn)一步提升其安全性,開(kāi)展臨床疾病診療和再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的研究奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

素 O（Streptolysin O，SLO）可與細(xì)胞膜表面的膽固醇受體生寡聚化，形成環(huán)狀的前孔（Pre-pore）結(jié)構(gòu)，隨后發(fā)生的膜中，最終在細(xì)胞膜上形成跨膜的大型雙性 β-桶狀孔道[11內(nèi)傳遞大分子物質(zhì)。但這種方式會(huì)導(dǎo)致靶細(xì)胞內(nèi)一些生物大定的毒害作用。研究表明尺寸較小的 NMs，例如小尺寸的金如碳納米管）[114]以及帶正電的 NPs（如樹(shù)枝狀分子）可以方式被動(dòng)進(jìn)入細(xì)胞[116, 117]，但是在穿透膜的過(guò)程中，會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)的離子、蛋白和其他大分子泄漏到膜外，，從而導(dǎo)致膜肽（Cell-penetrating peptide，CPP）可以穿透細(xì)胞膜且不 修飾的蛋白質(zhì)[18]和金納米顆粒[119]可以穿透細(xì)胞膜從而進(jìn)粒表面交替覆蓋帶有陰離子的疏水配體蛋白后，可以在細(xì)胞膜[120]。

圖 2 SPION 或 SPION-PEI 對(duì) HEK-293T 細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征的影響A.HEK-293T 細(xì)胞培養(yǎng) 12h 的對(duì)照組；B.10 ng/μl SPION-PEI 處理組；C.50 ng/μl SPION-PEI 處理組；D.100 ng/μlSPION-PEI 處理組；E.200 ng/μl SPION-PEI 處理組；F.400 ng/μl SPION-PEI 處理組；G.HEK-293T 細(xì)胞培養(yǎng) 24h 的對(duì)照組；H.10 ng/μl SPION 處理組；I.50 ng/μl SPION 處理組；J.100 ng/μl SPION 處理組；K.200 ng/μl SPION 處理組；L.400 ng/μl SPION 處理組；（A-L 200×）Fig.2 Effects of SPION or SPION-PEI on the morphology characteristics of HEK-293T cellsA.Control group, HEK-293T cells cultured for 12h; B.10 ng/μl SPION-PEI treatment group; C.50 ng/μl SPION-PEItreatment group; D.100 ng/μl SPION-PEI treatment group; E.200 ng/μl SPION-PEI treatment group; F.400 ng/μl SPION-PEItreatment group; G. Control group, HEK-293T cells cultured for 24h; H. 10 ng/μl SPION treatment group; I.50 ng/μl SPIONtreatment group; J.100 ng/μl SPION treatment group; K.200 ng/μl SPION treatment group; L.400 ng/μl SPION treatmentgroup; (A-L 200×)3.1.2 CCK-8 檢測(cè)由圖 3 和圖 4 的 CCK-8 檢測(cè)結(jié)果可知：相同濃度下，SPION-PEI 或 SPION 作用于HEK-293T 細(xì)胞 24 h 后的細(xì)胞存活率，10 ng/μl、50 ng/μl 處理組差異不顯著（P>0.05），其它各相同濃度處理組的差異顯著（P<0.05）。不同濃度 SPION 作用于 HEK-293T 細(xì)胞24h 后，隨著濃度的逐漸增加，細(xì)胞存活率逐漸降低，與 0 ng/μl 對(duì)照組相比，10 ng/μl、50 ng/μl處理組差異不顯著（101.72 5.54% vs 100.6 1.3%，93.9 3.94%；P>0.05）；100 ng/μl、
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R99;TB383.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2693058