【摘要】：化學(xué)發(fā)光(Chmiluminescence,CL)是化學(xué)反應(yīng)中反應(yīng)產(chǎn)物在反應(yīng)中獲得能量,生成激發(fā)態(tài)中間產(chǎn)物,中間產(chǎn)物從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時產(chǎn)生的光輻射。化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的強度與反應(yīng)中的反應(yīng)物濃度有關(guān),利用此原理,人們用化學(xué)發(fā)光強度來確定檢測物含量,即化學(xué)發(fā)光分析方法。化學(xué)發(fā)光分析法具有分析過程快、靈敏度高、線性范圍寬和操作過程簡單等優(yōu)點,已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生物分析、環(huán)境分析、臨床分析等領(lǐng)域。近年來,化學(xué)發(fā)光分析法也被應(yīng)用于生物分子的檢測,例如:抗原、抗體、特定序列DNA、酶等。目前,常用的化學(xué)發(fā)光體系主要有魯米諾(luminol)、光澤精、過氧草酸酯、三聯(lián)吡啶釕化學(xué)發(fā)光體系等。其中,魯米諾是其中應(yīng)用最為廣泛的化學(xué)發(fā)光試劑之一。在堿性條件下,魯米諾可以被不同的氧化劑氧化,生成激發(fā)態(tài)的3-氨基鄰苯二甲酸(3-aminophthalate,3-APA*),3-APA*從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時,釋放出最大波長位于425nm處的化學(xué)發(fā)光。魯米諾-過氧化氫體系是最為常見的魯米諾化學(xué)發(fā)光體系,其在沒有催化劑存在時化學(xué)發(fā)光信號較弱,在加入催化劑后化學(xué)發(fā)光信號明顯增強。辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)是一種天然的過氧化物酶,它可以顯著提高魯米諾-過氧化氫化學(xué)發(fā)光體系的化學(xué)發(fā)光強度。HRP的催化活性較高,目前已被廣泛應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光免疫分析,但是HRP作為天然酶有分離步驟較復(fù)雜,活性不穩(wěn)定,價格較高等缺點。因此,近年來發(fā)展新型的擬過氧化物酶已逐漸成為研究的熱點。納米材料模擬酶以其高穩(wěn)定性、低消耗、易于制備等優(yōu)點成為擬過氧化物酶研究的熱點。許多納米材料,例如金屬納米顆粒、金屬氧化物納米顆粒、金屬硫化物納米顆粒、碳材料、復(fù)合納米顆粒等均被發(fā)現(xiàn)具有擬過氧化物酶活性。研究表明,納米過氧化物模擬酶的催化活性與其粒徑大小有關(guān),粒徑較小的納米粒具有更高的催化活性。金納米簇(Gold nanoclusters,Au NCs)是一種新型的納米材料,與金納米粒子相比,金納米簇具有較小的體積、良好的穩(wěn)定性,并且具有熒光特性。因此,課題選擇金納米簇為研究對象。在2008年,Ying課題組報道了以牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)作為模板分子合成水溶性金納米簇。所制備的BSA-金納米簇具有良好的生物相容性,并且BSA模板為進一步對金納米簇進行表面修飾提供了修飾位點。Wang課題組報道了BSA-金納米簇與天然酶HRP相比對底物3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine,TMB)有更高的親和性。Chen課題組報道了以BSA為模板的金納米簇可以在堿性條件下催化魯米諾-過氧化氫化學(xué)發(fā)光反應(yīng),催化機理顯示,金納米簇可以催化過氧化氫分解產(chǎn)生大量活性中間體(例如:羥基自由基和超氧陰離子),羥基自由基和魯米諾分子反應(yīng)產(chǎn)生魯米諾自由基,魯米諾自由基與超氧陰離子自由基反應(yīng)產(chǎn)生不穩(wěn)定的中間體:激發(fā)態(tài)的3-APA*,激發(fā)態(tài)的3-APA*回到基態(tài)時最終產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。雖然金納米簇已被報道具有化學(xué)發(fā)光催化活性,但與HRP相比其催化活性還較低。納米模擬酶的催化活性除了與其粒徑相關(guān),還與納米酶的表面性質(zhì)有關(guān)。2009年,Prescott課題組報道影響氧化鐵納米粒子的擬過氧化物酶活性的主要因素是納米粒子的表面電荷及其與底物的親和性。Huang課題組報道了殼聚糖修飾的CoFe_2O_4納米粒子比未修飾的CoFe_2O_4納米粒子對魯米諾-過氧化氫化學(xué)發(fā)光體系具有更高的催化活性,這可能源自于帶正電荷的殼聚糖與底物魯米諾有更高的親和性。Huang課題組還合成了以Al_2O_3為支持物的CoFe_2O_4納米粒子,當(dāng)其在一定pH值條件下帶最高正電荷時,顯示了最高的化學(xué)發(fā)光催化活性。受以上工作的啟發(fā),論文致力于研究金納米簇表面性質(zhì)對其化學(xué)發(fā)光催化活性的影響,以獲得具有高效化學(xué)發(fā)光催化活性的金納米簇。經(jīng)過文獻調(diào)研,我們發(fā)現(xiàn)目前用于化學(xué)發(fā)光催化活性研究的金納米簇,都是以BSA為模板的金納米簇。BSA-金納米簇等電點在4.5左右,其在堿性的化學(xué)發(fā)光測定條件下帶負(fù)電荷,與同在堿性條件下帶負(fù)電荷的底物魯米諾陰離子靜電相斥,親和性不高。我們推測BSA-金納米簇在測定條件下帶負(fù)電荷,與底物魯米諾陰離子的親和性差,是導(dǎo)致金納米簇化學(xué)發(fā)光催化活性不高的原因之一。因此,課題以金納米簇為研究對象,通過對其進行表面修飾以及模板分子的變化,制備了兩種陽離子化的金納米簇,以期增加金納米簇與底物魯米諾的親和性,從而提高金納米簇的在luminol-H_2O_2化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中的催化活性。在第二章中,我們采用后修飾法制備了陽離子化金納米簇,以未修飾金納米簇為對照,研究了表面電荷對金納米簇化學(xué)發(fā)光催化活性的影響。研究內(nèi)容詳述如下:通過EDC反應(yīng),我們將乙二胺修飾在以BSA為模板的金納米簇表面。修飾后的陽離子化金納米簇具有良好的分散性,高倍透射電鏡結(jié)果顯示陽離子化金納米簇的大小在1.8到2.9納米之間。Zeta電位測定顯示未修飾的BSA-金納米簇等電點在4.5左右,當(dāng)溶液的pH值大于5時,BSA-金納米簇帶負(fù)電荷;修飾后的陽離子化金納米簇的等電點則顯著提高,溶液pH在4到9范圍內(nèi),陽離子化金納米簇均帶正電荷。在pH為9的測定條件下,將未修飾的BSA-金納米簇加入到魯米諾-過氧化氫體系中,該體系的化學(xué)發(fā)光強度增強了21倍;平行試驗中,將陽離子化金納米簇加入魯米諾-過氧化氫體系后,該體系的化學(xué)發(fā)光強度增強了170倍。以上結(jié)果表明陽離子化金納米簇相較于未修飾的金納米簇具有更高的化學(xué)發(fā)光催化活性。我們分別優(yōu)化了luminol-H_2O_2-金納米簇和luminol-H_2O_2-陽離子化金納米簇的化學(xué)發(fā)光測定條件,在優(yōu)化的實驗條件下,觸發(fā)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)所需的陽離子化金納米簇的檢測限為14 nM,而對未修飾的BSA-金納米簇的最低濃度為110 nM,表明陽離子化金簇在催化魯米諾-過氧化氫反應(yīng)中靈敏度提升了約10倍。化學(xué)發(fā)光催化機理研究顯示,陽離子化金納米簇能催化過氧化氫分解,產(chǎn)生多種含氧自由基,并且與未修飾金納米簇相比,陽離子化金納米簇更有利于單線態(tài)氧的生成。除此之外,動力學(xué)研究顯示,金納米簇催化luminol化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的米氏常數(shù)(K_m)為2.085,陽離子化金納米簇催化luminol化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的Km值為1.182。以上結(jié)果表明,陽離子化金納米簇較未修飾金納米簇對底物luminol陰離子具有更高的親和性。綜合以上結(jié)果,我們推測在陽離子化金簇表面或周圍能產(chǎn)生大量的單線態(tài)氧,并且在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的最佳pH條件下,底物魯米諾分子帶負(fù)電荷,負(fù)電荷的魯米諾分子與帶正電荷的陽離子化金納米簇相互作用更強,有利于單線態(tài)氧與魯米諾陰離子作用產(chǎn)生更多的3-APA*,最終產(chǎn)生更強的化學(xué)發(fā)光。此外,我們也以2'-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid,ABTS)為底物,比較了陽離子化金納米簇和未修飾金納米簇在不同pH條件下的擬過氧化物酶活性。當(dāng)pH為5時,陽離子化金納米簇的催化活性是未修飾的金納米簇的2倍。而當(dāng)pH為6和7時,未修飾的金納米簇對ABTS反應(yīng)幾乎沒有催化活性,而陽離子化金納米簇仍然可以催化H_2O_2氧化ABTS產(chǎn)生特征的顏色反應(yīng)。我們推測這是由于陽離子化金納米簇在測定pH 5-7下帶正電荷,相較于帶負(fù)電荷的BSA-金納米簇,其與帶負(fù)電荷的底物ABTS有更好的親和性,所以陽離子化金納米簇在pH 5-7均顯示了良好的催化活性。穩(wěn)定性實驗中,我們考察了天然酶HRP、未修飾的BSA-金納米簇和陽離子化金簇對溫度的耐受性。將天然酶HRP、未修飾的BSA-金納米簇和陽離子化金簇在不同溫度下處理2 h后,測定其催化產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光強度。結(jié)果顯示,未修飾的金納米簇和陽離子化的金納米簇在經(jīng)過20-80℃處理后均具有穩(wěn)定的化學(xué)發(fā)光催化活性。而天然酶HRP在經(jīng)過30℃以上的預(yù)處理后,催化活性逐漸降低。以上結(jié)果表明,納米過氧化物酶較天然過氧化物酶具有更好的熱穩(wěn)定性。綜上,陽離子化金簇較未修飾金納米簇具有更好的化學(xué)發(fā)光催化活性,且具有良好的熱穩(wěn)定性,其在化學(xué)發(fā)光分析、生物分析和環(huán)境化學(xué)等方面具有良好的應(yīng)用前景。除此之外,本研究采用后修飾法制備陽離子化金簇,以提高其化學(xué)發(fā)光催化活性,本方法為提高其他納米簇、納米微粒擬過氧化物酶的化學(xué)發(fā)光催化活性提供了新的途徑。聚乙烯亞胺(Polyethyleneimine,PEI)是一種帶正電荷的支鏈聚胺化合物。PEI具有大量伯胺、仲胺和叔胺基團,可與金屬離子進行螯合,是一種納米微粒表面陽離子化修飾的常用材料。在第三章中,我們選擇PEI作為模板,谷胱甘肽(Glutathione,GSH)為還原劑,參考文獻方法以一步法制備了PEI陽離子化金納米簇。相較于第二章的后修飾法制備陽離子化金簇,該方法以帶正電荷的PEI為模板直接合成陽離子化金納米簇,不需要在已經(jīng)合成的金納米簇表面進行再修飾,具有步驟簡單、快速的優(yōu)點。研究內(nèi)容詳述如下:我們以所制備得到PEI-金納米簇的化學(xué)發(fā)光催化活性為指標(biāo),優(yōu)化了PEI金納米簇的制備條件,包括反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、PEI用量、PEI分子量以及GSH/[AuCl]~-摩爾比等。在最佳實驗條件下,我們制備得到PEI陽離子化金納米簇,并分別采用紫外可見分光光度法、熒光分光光度法、高倍透射電鏡、zeta電位等對其進行了表征。高倍透射電鏡結(jié)果顯示,合成的PEI陽離子化金納米簇粒徑小于2 nm,呈球狀并且具有較好的分散性。Zeta電位顯示PEI陽離子化金納米簇在溶液pH值小于11時均帶強烈的正電荷。熒光光譜顯示,PEI陽離子化金納米簇在280 nm處激發(fā)時,熒光發(fā)射波長位于800 nm左右產(chǎn)生了一個較強的熒光峰。化學(xué)發(fā)光分析顯示,以PEI為模板制備的陽離子化金納米簇能催化魯米諾-過氧化氫化學(xué)發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生慢化學(xué)發(fā)光信號。luminol-H_2O_2體系中加入PEI陽離子化金納米簇后,體系化學(xué)發(fā)光信號緩慢增強,并在約600 s達到最強,與空白相比PEI陽離子化金納米簇催化所產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光強度增強了38倍�；瘜W(xué)發(fā)光光譜分析顯示,luminol-H_2O_2-PEI陽離子化金納米簇化學(xué)發(fā)光體系的最大發(fā)射波長位于425 nm,與luminol-H_2O_2-陽離子化BSA金納米簇化學(xué)發(fā)光體系類似,發(fā)光物仍舊是激發(fā)態(tài)的3-APA*,體系中沒有產(chǎn)生新的發(fā)光物。為研究PEI陽離子化金納米簇催化luminol-H_2O_2體系產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的機理,我們將多種自由基淬滅劑引入到了化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中,包括疊氮化鈉、DMSO、氯化硝基四氮唑藍(lán)(Nitrotetrazolium blue chloride,NBT)等。我們將此體系的淬滅實驗結(jié)果與第二章中的自由基淬滅實驗進行了比較,兩種陽離子化金納米簇催化的luminol-H_2O_2反應(yīng)顯示了相似的自由基淬滅結(jié)果。與陽離子化BSA-金納米簇相似,羥基自由基和單線態(tài)氧在化學(xué)發(fā)光體系中扮演了重要的角色。我們推測大量單線態(tài)氧在PEI陽離子化金納米簇表面或周圍產(chǎn)生,由于陽離子化金簇表面的正電荷,使得負(fù)電荷的luminol陰離子與PEI陽離子化金納米簇有強的相互作用,促進單線態(tài)氧氧化luminol陰離子產(chǎn)生大量的激發(fā)態(tài)的3-APA*,從而得到增強的化學(xué)發(fā)光信號。同時,PEI陽離子化金納米簇也可以催化ABTS反應(yīng)產(chǎn)生顏色反應(yīng)。表觀動力學(xué)參數(shù)顯示,在以ABTS為底物時,PEI金納米簇催化的K_m值明顯小于天然酶HRP。表明PEI陽離子化金納米簇相較于HRP對于帶負(fù)電荷的底物ABTS有更高的親和性。除此之外,干擾實驗顯示,1 mM的Na~+、K~+、HPO_4~(2-),、H_2PO_4~-、Ca~(2+)、Ba~(2+)、Li~+,0.1 mM的Fe~(2+)、Mn~(2+)、Cd~(2+),0.01 mM的Cu~(2+)、Cr~(3+)、Fe~(3+)、Ni~(2+),和1μM的Ag~+,Co~(2+)對luminol-H_2O_2-PEI陽離子化金納米簇化學(xué)發(fā)光體系無干擾。總之,我們用兩種方法合成了陽離子化金納米簇。增加了金納米簇與底物luminol的親和性,從而提高金納米簇的在luminol-H_2O_2化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中的催化活性。為制備高催化活性的納米微粒擬過氧化物酶提供了更多方式。
【學(xué)位授予單位】：天津大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：TB383.1;O643.36

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本文編號：2683104