【摘要】：即時(shí)診斷(Point-Of-Care Testing,POCT)首次出現(xiàn)于20世紀(jì)90年代,是屬于體外診斷器械的一個(gè)細(xì)分行業(yè)。由于其關(guān)注病人身邊的及時(shí)快速檢測(cè),所以也常被稱為床旁檢測(cè)、分散檢驗(yàn)、現(xiàn)場(chǎng)替代檢測(cè)等。2016年9月,Yole Développement公司在年度分析報(bào)告中,將“即時(shí)診斷”這個(gè)概念更新為“即時(shí)需求診斷(Point-of-Need Testing,PoNT)”。與即時(shí)診斷相比,即使需求診斷包含了更大的檢測(cè)范圍,除了人類疾病相關(guān)的檢測(cè),也包括獸醫(yī)檢驗(yàn)、工業(yè)檢驗(yàn)(油、氣體以及化學(xué)品等)、農(nóng)業(yè)食品檢測(cè)(奶制品、食品、飲料、莊稼等)、環(huán)境監(jiān)測(cè)(水質(zhì)監(jiān)控和細(xì)菌檢測(cè)等)和法醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。微流控(Microfluidics)技術(shù)是一種依托于現(xiàn)代微加工工藝,在微米尺度下的處理和操縱微流體的技術(shù)手段。這種技術(shù)可實(shí)現(xiàn)采樣、稀釋、加試劑、分離、檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)步驟并可將各種生化反應(yīng)集成在幾平方厘米或更小的芯片上,從而減少樣品和試劑的消耗、提高檢測(cè)靈敏度、縮短反應(yīng)時(shí)間并降低平均成本。微流控技術(shù)的核心是高度集成、微型化的芯片,該技術(shù)可滿足從生物小分子到細(xì)胞等不同尺度對(duì)象的檢測(cè)需求,并通過(guò)在后端耦合光、電、熱等形式的檢測(cè)器和讀數(shù)裝置,實(shí)現(xiàn)檢測(cè)流程的自動(dòng)化和檢測(cè)結(jié)果的信息化�；谖⒘骺丶夹g(shù)的診斷儀器的微型化、集成化、自動(dòng)化的特性,高度切合PoNT的發(fā)展需求,對(duì)優(yōu)化臨床檢測(cè)具有重要意義。近年來(lái)已日漸成為PoNT領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和核心技術(shù)。PCR芯片就是在這種趨勢(shì)下誕生的。PCR芯片不只是微流控芯片的一個(gè)應(yīng)用,其樣本驅(qū)動(dòng)、溫度控制和信號(hào)檢測(cè)等功能需要結(jié)合微機(jī)電系統(tǒng)(MEMS,MicroElectro-Mechanical System)的技術(shù),尤其是在便攜式的PCR檢測(cè)設(shè)備中。本文探索了利用多壁碳納米管作為傳熱介質(zhì)并結(jié)合紅外LED作為便攜式PCR儀加熱方式的可行性,開(kāi)發(fā)了三套PCR平臺(tái)及其配套的微流控芯片與PCR產(chǎn)物檢測(cè)方法。在這三套平臺(tái)中,主要控制原理均是通過(guò)PID算法和脈沖寬度調(diào)制技術(shù)控制紅外LED的電壓信號(hào)從而調(diào)節(jié)紅外LED輸出功率的大小從而調(diào)節(jié)升溫的快慢,而降溫控制和PCR產(chǎn)物的檢測(cè)方式各不相同。在紅外激發(fā)的導(dǎo)熱油與碳納米管循環(huán)流動(dòng)PCR平臺(tái)中(IR mediated Conducting Oil and CarbOn Nanotube circUlaTing PCR,IRCOCONUT PCR),我們?cè)O(shè)計(jì)了多層的微流控芯片,利用銅箔對(duì)導(dǎo)熱油層和PCR腔室層進(jìn)行傳熱,降溫過(guò)程通過(guò)PID算法和脈沖寬度調(diào)制技術(shù)控制蠕動(dòng)泵的轉(zhuǎn)速?gòu)亩鴮⑿酒瑑?nèi)高溫的導(dǎo)熱油用油箱里低溫的導(dǎo)熱油取代實(shí)現(xiàn)降溫功能。在這部分試驗(yàn)中,我們利用HPV 16型作為演示,對(duì)IR-COCONUT PCR平臺(tái)的性能進(jìn)行了驗(yàn)證。試驗(yàn)表明,IRCOCONUT PCR平臺(tái)升溫速度可以達(dá)到1.5°C/s,降溫速度可以達(dá)到-2.0°C/s,與商用PCR儀性能相當(dāng)。隨后,為了減少樣本測(cè)量中的人工操作,我們?cè)O(shè)計(jì)了與微流控芯片配套的緩沖液芯片、層流分析試紙條以及層流分析試紙條支架。最終,我們利用IR-COCONUT PCR平臺(tái)、微流控芯片和層流分析試紙條,在50分鐘之內(nèi)完成30個(gè)溫度循環(huán)并在25分鐘之內(nèi)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的快速檢測(cè)。在第二個(gè)紅外PCR平臺(tái)中,我們利用了3D打印設(shè)計(jì)了底部有微腔室的微流控芯片,該芯片可以在一次進(jìn)樣后將樣本分區(qū)并保證各分區(qū)間沒(méi)有交叉污染。同時(shí),與IR-COCONUT平臺(tái)中的微流控芯片不同的是,在底部有微腔室的微流控芯片中,導(dǎo)熱油與樣本是直接接觸的。在與之配套的PCR平臺(tái)中,我們?cè)O(shè)計(jì)了用于熒光檢測(cè)的光路支架:支架上方為紅外LED,用于對(duì)主通道中的導(dǎo)熱油與碳納米管進(jìn)行加熱,支架下方為藍(lán)光LED、濾光片以及CCD攝像頭,用于對(duì)PCR產(chǎn)物的熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè),支架側(cè)方為USB風(fēng)扇,通過(guò)PID算法和脈沖寬度調(diào)制技術(shù)控制風(fēng)扇的轉(zhuǎn)速?gòu)亩鴮?duì)芯片進(jìn)行對(duì)流降溫。隨后,我們利用Ansys對(duì)微腔室的結(jié)構(gòu)尺寸以及傳熱進(jìn)行了仿真模擬并優(yōu)化了微流控芯片的設(shè)計(jì)。該紅外PCR平臺(tái)和PDMS微流控芯片升溫速度可以達(dá)到2.5°C/s,降溫速度為-0.9°C/s,可在90分鐘內(nèi)完成40個(gè)循環(huán)。通過(guò)CCD攝像頭在每個(gè)循環(huán)延伸結(jié)束時(shí)采集熒光照片,隨后通過(guò)軟件去掉背景光等干擾,可以成功檢測(cè)病人HPV 3種亞型的感染情況。最后我們開(kāi)發(fā)了紅外激發(fā)的RNA恒溫?cái)U(kuò)增PCR平臺(tái)(IR MEdiated RNA Isothermal RT-PCR,IR-MERIT PCR),該平臺(tái)主要由三個(gè)模塊組成:溫度控制模塊、熒光檢測(cè)模塊和定位模塊。由于該平臺(tái)用于恒溫?cái)U(kuò)增,因此只需利用PID算法和PWM信號(hào)控制紅外LED即可實(shí)現(xiàn)控溫功能,而不再需要實(shí)現(xiàn)降溫功能的硬件。我們利用3D打印制作了定位模塊的主要部件,可靈活得實(shí)現(xiàn)多腔室熒光信號(hào)的采集。我們還利用圖案化的材料制作了具有三維通道結(jié)構(gòu)的微流控芯片,這種制作方式更便于集成微泵、微混合器以及微閥等功能。最后,我們利用IR-MERIT PCR、微流控芯片以及光電二極管實(shí)現(xiàn)了沙眼衣原體、解脲脲原體以及生殖支原體三種疾病的同時(shí)檢測(cè)。我們?cè)O(shè)計(jì)的三套PCR平臺(tái)及其配套的微流控芯片展示了其在現(xiàn)場(chǎng)和即時(shí)需求診斷領(lǐng)域?qū)蚧騻魅静〉目焖贆z測(cè)能力,對(duì)設(shè)計(jì)、制作小型化的便攜檢測(cè)儀器提供了技術(shù)方案。
【圖文】：

上海交通大學(xué)博士學(xué)位論文獻(xiàn)報(bào)道用粗血清實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí) PCR 或者用預(yù)加熱處理的血液直接實(shí)現(xiàn) LAMP 恒溫?cái)U(kuò)增[65]。然而對(duì)于大多數(shù)情況，樣本的前處理是必需的，而且對(duì)紙基微流控來(lái)說(shuō)也是一項(xiàng)挑戰(zhàn)[66]。有些樣本預(yù)處理是在芯片外部實(shí)現(xiàn)的，，如利用自動(dòng)或手動(dòng)的非便攜設(shè)備實(shí)現(xiàn)痰液[67]、唾液[68]、糞便[69]或尿液[70]的處理，這也是目前大多數(shù)商用 POCT 設(shè)備的現(xiàn)狀，所幸的這個(gè)現(xiàn)狀正在眾多研究人員的努力下漸漸改變[70-73]。由于樣本的來(lái)源有多種可能性，因此樣本的動(dòng)力黏度也是在一個(gè)較大的范圍內(nèi)波動(dòng)，大約為 1×10-3到 30Pa·s[74-76]。根據(jù) Lucas-Washburn 定律，流速與粘度平方的倒數(shù)成反比，這會(huì)限制有些樣本的移動(dòng)距離小到只有幾個(gè)毫米。而實(shí)際中很多作者找到了相應(yīng)的解決辦法。在實(shí)際樣本中，尿液（動(dòng)力黏度約為 8mPa·s）是不需要考慮黏性因素的[77]。尿液分析試紙[78]、驗(yàn)孕棒[79]和一些早期層流分析紙[80]是直接用紙吸取尿液樣本的，但對(duì)于一些傳染性疾病，尿液是否是一個(gè)合適的樣本是有爭(zhēng)議性的[81]，比如尿液成分僅能對(duì) HIV 感染者進(jìn)行結(jié)核檢測(cè)。唾液（動(dòng)力黏度約為 8mPa·s[82]）也是可以不用稀釋直接處理的樣本。唾液大概能在紙基微流控通道中流過(guò) 2cm 的距離，所以也有研究者為了使之流經(jīng)更長(zhǎng)的距離而在實(shí)際分析中引入了稀釋的步驟[83]。唾液的稀釋是通過(guò)搭接試紙條實(shí)現(xiàn)的，而且稀釋的比例也是可調(diào)的[84]。值得注意的是，近年來(lái)有很多檢測(cè) HIV、丙型肝炎和 HPV 的病原都是采用的唾液樣本做的[85]。盡管精液黏度比較大[86]，但不用稀釋也是可以直接用紙基檢測(cè)的；而目前基于紙基的檢測(cè)還沒(méi)有直接用痰液（動(dòng)力黏度約為 20-70mPa·s[87]）作樣本的。

上海交通大學(xué)博士學(xué)位論文1.4.2 全血過(guò)濾血液是非常重要的一種復(fù)雜樣本，其是有紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板、外泌體和其他一些生物分子等組成。由于其成分的復(fù)雜性，因此多數(shù)情況下必須經(jīng)過(guò)過(guò)濾，避免其中的一些成分干擾擴(kuò)增。而目前基于尺寸排阻的層析法可以成功移除免疫球蛋白 G、血紅蛋白（紅細(xì)胞中）和乳鐵蛋白[89]（白細(xì)胞中）等對(duì) PCR 擴(kuò)增有顯著抑制作用的成分。紙的多孔微結(jié)構(gòu)和其具有的毛細(xì)作用力可以自發(fā)的根據(jù)尺寸過(guò)濾紅細(xì)胞，再結(jié)合有些抗體可以促使紅細(xì)胞團(tuán)聚，因此利用這個(gè)特性直接從血液中提取血漿。血和紙?jiān)卺t(yī)院婦產(chǎn)科中被用作新生兒血型化驗(yàn)已經(jīng)有幾十年的歷史了[90]：格思里氏試驗(yàn)卡可以用作儲(chǔ)存指尖血血跡，而干血跡可以保存數(shù)天到數(shù)月而不失效。在核酸擴(kuò)增檢測(cè)領(lǐng)域，干血跡主要用來(lái)做 HIV 的檢測(cè)[91, 92]，其他疾病[93]如血紅蛋白病、Duchenne 型肌營(yíng)養(yǎng)不良和囊性纖維化也要報(bào)道。
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：TH77;TB383.1

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本文編號(hào)：2661860