【摘要】：循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)檢測(cè)被認(rèn)為是一種極具發(fā)展前景的癌癥液體活檢技術(shù)。然而,血液中的CTCs數(shù)量非常稀少,并且存在異質(zhì)性,使得從血液樣品中高效捕獲高純度、高活性的CTCs成為一項(xiàng)極具挑戰(zhàn)性的任務(wù)。納米結(jié)構(gòu)基底的引入提高了 CTCs的捕獲效率,然而也增加了對(duì)血液中白細(xì)胞的捕獲,白細(xì)胞對(duì)于CTCs的鑒定、分析和應(yīng)用具有嚴(yán)重的干擾,因此對(duì)于CTCs的研究首先需要建立能夠高效高純度、高活性捕獲CTCs的平臺(tái)。基于上述目的,本論文的研究?jī)?nèi)容嘗試從“材料選擇、界面構(gòu)筑、分子設(shè)計(jì)、釋放策略”等方面進(jìn)行設(shè)計(jì),構(gòu)建了包括納米纖維@水凝膠基底、抗粘附納米水凝膠基底、溫敏納米纖維基底、水凝膠@磁納米顆�；准盁晒怆p抗體磁納米顆粒基底在內(nèi)的幾種CTCs捕獲與純化平臺(tái),并詳細(xì)研究了其抗粘附、特異性、靈敏度等相關(guān)性能,主要內(nèi)容包括以下五個(gè)部分:1.通過(guò)自由基聚合反應(yīng)在玻璃片表面修飾一層聚羧酸甜菜堿甲基丙烯酸甲酯(PCBMA)水凝膠,該水凝膠層既可以起到抗粘附作用提高CTCs的捕獲純度,又提供了一個(gè)類似于細(xì)胞外基質(zhì)的柔軟界面。為提高捕獲效率,通過(guò)靜電紡絲技術(shù)在水凝膠表面電紡一層殼聚糖納米纖維使捕獲基底具有納米結(jié)構(gòu),最后引入上皮粘附分子(EpCAM)抗體作為親和捕獲分子用于特異性捕獲EpCAM高表達(dá)的CTCs。該基底通過(guò)親和捕獲分子、納米結(jié)構(gòu)和水凝膠抗粘附的協(xié)同作用完成了CTCs的高純度高效捕獲。2.上述捕獲基底,雖然對(duì)CTCs捕獲有較好的捕獲效率和特異性,然而其基底制備過(guò)程復(fù)雜繁瑣,因此在上一個(gè)工作的基礎(chǔ)上,期望構(gòu)建一種制備簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)的捕獲基底。在該工作中,以甲基丙烯酸磺酸甜菜堿(SBMA)和甲基丙烯酸(MAA)為單體,N'N-亞甲基雙丙烯酰胺(MBA)為交聯(lián)劑,通過(guò)回流沉淀聚合方法制備水凝膠納米球,將其修飾到玻片表面構(gòu)建了水凝膠納米結(jié)構(gòu)基底,引入EpCAM抗體作為親和捕獲分子。該基底本身具有良好的抗粘附性能,無(wú)需進(jìn)一步修飾抗粘附分子,簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)過(guò)程。最后進(jìn)行了臨床病人血樣檢測(cè),4例癌癥患者1 mL血液中檢測(cè)到1-32個(gè)CTCs,而作為對(duì)照的5例健康血樣中均未檢測(cè)到CTCs。3.對(duì)于CTCs的純度,可以通過(guò)其特異性釋放進(jìn)一步提高,且CTCs的釋放對(duì)于CTCs的后續(xù)研究同樣具有重要的意義,因此在該工作中,利用靜電紡絲技術(shù)制備了殼聚糖納米纖維基底,通過(guò)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合方法(ATRP)將N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)和MAA修飾在納米纖維表面,最后引入EpCAM適配體。利用PNIPAM的構(gòu)象改變過(guò)程清除基底上的非特異性吸附的血細(xì)胞,使捕獲的CTCs得到純化。此外,通過(guò)互補(bǔ)序列(CS)高效的與適配體雜交實(shí)現(xiàn)捕獲的CTCs無(wú)損釋放,由于細(xì)胞釋放過(guò)程是特異性作用,這使得釋放的CTCs進(jìn)一步得到純化。4.由于納米結(jié)構(gòu)基底捕獲方式的局限性,可能導(dǎo)致其在臨床樣本應(yīng)用中捕獲靈敏度的降低。不同于納米結(jié)構(gòu)基底的捕獲方式,磁性納米顆粒分離細(xì)胞屬于均相溶液法,可以促進(jìn)磁納米顆粒與CTCs的接觸,從而提高CTCs在血液樣本中的檢測(cè)靈敏度和捕獲效率�；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果,將甜菜堿類兩性離子化合物引入磁納米顆粒表面用于減少磁納米顆粒對(duì)非特異性細(xì)胞的吸附。在該工作中,以SBMA和MAA作為單體,以含有雙硫鍵的N,N-雙(丙稀酰)胱胺(BACy)為交聯(lián)劑,通過(guò)回流沉淀聚合方法在磁納米顆粒表面形成水凝膠殼。通過(guò)利用水凝膠層和EpCAM抗體的協(xié)同作用,一方面降低血細(xì)胞的粘附提高靶細(xì)胞的捕獲純度,另一方面通過(guò)谷胱甘肽降解水凝膠層清除捕獲細(xì)胞表面的磁珠,最終得到完整無(wú)損的CTCs。5.上述捕獲基底使用的親和分子是單一的EpCAM抗體,然而在CTCs的研究中發(fā)現(xiàn)CTCs會(huì)經(jīng)歷間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化后的部分CTCs膜表面EpCAM表達(dá)降低或者消失,因此單一抗體的使用造成對(duì)這部分細(xì)胞檢測(cè)的損失。而轉(zhuǎn)化后的CTCs可能是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵,對(duì)于這部分細(xì)胞的捕獲具有重要的意義。因此基于上述工作的基礎(chǔ)和對(duì)轉(zhuǎn)化后CTCs捕獲的需求,在該工作中,利用Stober方法在磁珠表面包裹二氧化硅層,同時(shí)包埋DiI染料,使磁珠帶有熒光,然后接枝線性聚合物分子PCBMA。PCBMA不僅為EpCAM和神經(jīng)型鈣粘附蛋白(N-cadherin)兩種抗體的修飾提供多位點(diǎn),而且能夠有效降低血細(xì)胞的粘附。N-cadherin是轉(zhuǎn)化后CTCs主要表達(dá)的一種蛋白。利用兩種抗體的協(xié)同作用,不僅能高效捕獲EpCAM表達(dá)的CTCs,也能高效捕獲間充質(zhì)轉(zhuǎn)化后EpCAM低表達(dá)或者不表達(dá)的CTCs。
【圖文】：

［逡逑Ｌ邐ｔｕｍｏｕｒ邋ｃｅｌｌｓ逡逑圖１．１邋ＣＴＣｓ轉(zhuǎn)移過(guò)程示意圖１６１逡逑１．１．２循環(huán)腫瘤細(xì)胞的應(yīng)用逡逑雖然ＣＴＣｓ數(shù)量稀少，但是血液樣本獲取方便，并且它可能攜帶腫瘤多方面逡逑信息，使ＣＴＣｓ檢測(cè)被認(rèn)為是一種極具發(fā)展前景的癌癥液體活檢技術(shù)Ｉ％。該技術(shù)逡逑能通過(guò)非侵入性的方式獲取腫瘤分子水平上的信息，因而對(duì)于腫瘤的早期診斷、逡逑預(yù)后監(jiān)控、藥物評(píng)估、個(gè)體化治療以及理解轉(zhuǎn)移機(jī)理都具有重要意義［１９＿Ｍ］。因此，逡逑近十幾年，對(duì)ＣＴＣｓ的研究已經(jīng)成為一個(gè)非常活躍的領(lǐng)域。２０１４年６月在ＰｕｂＭｅｄ逡逑的關(guān)鍵詞“循環(huán)腫瘤細(xì)胞”中列出了超過(guò)１５，１９０種出版物，ＣＴＣｓ在逡逑ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ注冊(cè)的大于２７０項(xiàng)臨床試驗(yàn)中被用作生物標(biāo)志物［２１］。逡逑ＣＴＣｓ的精確計(jì)數(shù)可以用于腫瘤分期的輔助手段［２２］、療效監(jiān)控復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)逡逑【２４】、預(yù)后評(píng)估［２５＿２６］等臨床應(yīng)用。例如，研宄發(fā)現(xiàn)在７．５ｍＬ血液樣本中檢測(cè)到多逡逑于５個(gè)ＣＴＣｓ

圖１．２循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集技術(shù)ｍｉ逡逑目前，基于循環(huán)腫瘤細(xì)胞的物理性質(zhì)和生物性質(zhì)己經(jīng)有許多技術(shù)用于分離逡逑ＣＴＣｓ，如圖１．２［￣。基于物理性質(zhì)的分離方法主要是依賴于ＣＴＣｓ的大小、變形逡逑性、密度、或介電特性等與正常血細(xì)胞不同［３９］。密度梯度離心法、濾膜過(guò)濾方法、逡逑水動(dòng)力分離法和介電泳（ＤＥＰ）細(xì)胞分離法等技術(shù)已經(jīng)被發(fā)展用于從血液中提取逡逑ＣＴＣｓ［４（Ｍ３］。密度梯度離心法通常依靠分離液來(lái)分離細(xì)胞，ｃＴＣｓ主要在單核細(xì)胞逡逑富集層，使ＣＴＣｓ的純度降低，不利于后期的鑒定［４Ｑ］。過(guò)濾方法通常能夠?qū)崿F(xiàn)高逡逑通量分離，，然而由于ＣＴＣｓ的大小不均一性，過(guò)濾膜可能將大的血細(xì)胞截留而不逡逑３逡逑
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TB383.1;R730.4

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7 歐陽(yáng)s

本文編號(hào)：2661818