【摘要】：腦缺血是以腦循環(huán)血流量減少為特征的腦血管疾病,具有高發(fā)病率、高致殘率、高致死率的特點,已成為全球性的健康問題。而缺血性腦卒中約占腦卒中的70%-80%,不容忽視。我國衛(wèi)生部2011年發(fā)布的《中國卒中宣言》指出,腦卒中已經(jīng)成為我國第一大致死疾病,發(fā)病率高居世界首位。在我國,每年用于腦卒中患者的醫(yī)藥費和護理費等開支巨大,給患者家庭和社會帶來了沉重的經(jīng)濟負擔(dān),也給臨床護理人員帶來了繁重的護理負擔(dān)。因此,腦缺血的預(yù)防顯得尤為重要,腦缺血一級預(yù)防的意義遠大于二級和三級預(yù)防,即在尚未出現(xiàn)卒中或有危險因素時即給予干預(yù)和護理,降低卒中風(fēng)險,提高機體自身抵抗能力,以達到避免或減少卒中的損害嚴(yán)重程度的目的。目前亟需安全有效的一級預(yù)防措施。慢性間歇性低壓低氧(chronic intermittent hypobaric hypoxia,CIHH)對機體具有多種有益效應(yīng),長時間以來都被用于一些疾病的預(yù)防和治療,但其可否用于預(yù)防腦卒中及其相關(guān)機制還待進一步研究。近年,線粒體作為腦缺血性損傷的亞細胞靶目標(biāo),在腦保護中的作用越來越受到重視。研究發(fā)現(xiàn),腦缺血預(yù)處理與線粒體內(nèi)膜ATP敏感性鉀通道(mitochondrial membrane ATP sensitive potassium channels,mito KATP)有關(guān),應(yīng)用mito KATP的阻斷劑5-羥基癸酸鹽(5-hydroxydeenoate,5-HD)可以阻斷腦缺血耐受,提示mito KATP可能也參與了腦缺血耐受的形成,但mito KATP在CIHH誘導(dǎo)腦缺血耐受過程中的作用還不十分清楚。目的:建立大鼠全腦缺血模型,明確CIHH可以誘導(dǎo)腦缺血耐受,并探討mito KATP通道在其中的作用及其可能機制。方法:健康雄性Wistar大鼠隨機分為以下7組:(1)對照組(Control組):不接受任何處理;(2)假手術(shù)組(Sham組):永久凝閉雙側(cè)椎動脈,2 d后游離雙側(cè)頸總動脈,但不夾閉;(3)慢性間歇性低壓低氧組(CIHH組):大鼠接受模擬5000米海拔低壓低氧環(huán)境,每天6小時,持續(xù)28天的CIHH適應(yīng)處理;(4)腦缺血組(ISH組):永久凝閉雙側(cè)椎動脈,2 d后夾閉雙側(cè)頸總動脈8 min致全腦缺血;(5)慢性間歇性低壓低氧+腦缺血組(CIHH+ISH組):大鼠接受模擬5000米海拔低壓低氧環(huán)境,每天6小時,持續(xù)28天的CIHH適應(yīng)處理后,永久凝閉雙側(cè)椎動脈,2 d后夾閉雙側(cè)頸總動脈8 min致全腦缺血;(6)缺血前30分鐘給予5-HD腹腔注射(40 mg/kg),其余實驗步驟同第5組;(7)5-羥基癸酸鹽+假手術(shù)組(5-HD+Sham組):永久凝閉雙側(cè)椎動脈,2 d后游離雙側(cè)頸總動脈前30分鐘給予5-HD腹腔注射(40 mg/kg),但不夾閉頸總動脈。實驗觀察內(nèi)容包括如下步驟:(1)實驗動物于造模完成后30天開始采用Morris水迷宮實驗(Morris water maze,MWM)觀測各組實驗動物學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)功能,在行為學(xué)實驗結(jié)束后,取海馬行硫堇染色觀察CA1區(qū)錐體神經(jīng)元遲發(fā)性壞死(delayed neuronal death,DND)情況。(2)CIHH預(yù)處理結(jié)束后0 h,6 h,1 d,3 d,7 d和10 d等各時間點海馬CA1區(qū)mito KATP的亞基Kir6.2,SUR1的蛋白的動態(tài)表達。(3)mito KATP的亞基Kir6.2,SUR1于缺血后2 d和7 d時在海馬CA1區(qū)不同組間的蛋白表達比較;(4)在缺血后1 d時(其他各組在相應(yīng)時間點),取海馬CA1區(qū),采用western blot技術(shù)分別觀察Cytochrome c在線粒體和胞漿中的蛋白表達情況,來比較CIHH預(yù)處理是否抑制了缺血所引起的凋亡;(5)在缺血后1 d時(其他各組在相應(yīng)時間點),取海馬CA1區(qū),采用流式細胞技術(shù)觀察各組神經(jīng)元線粒體膜電位(Mitochondrial membrane potential,ΔΨm)的變化,通過使用5-HD來驗證CIHH預(yù)處理誘導(dǎo)的腦缺血耐受是否由mito KATP介導(dǎo);(6)在缺血后3 d時(其他各組在相應(yīng)時間點),取海馬CA1區(qū)組織,采用透射電鏡觀察不同處理組椎體神經(jīng)元及線粒體超微結(jié)構(gòu)。統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理,各時間點兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗,多組之間的兩兩比較采用多樣本方差分析,HG采用Kruska-Wallis法進行多樣本等級資料的秩和檢驗,P0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果:1在水迷宮的尋臺潛伏期實驗中,各組大鼠隨著訓(xùn)練增加,逃避潛伏期均呈現(xiàn)出逐漸縮短的趨勢。Sham組和CIHH組大鼠相比,逃避潛伏期無顯著性差異;在第4天時,ISH組大鼠的逃避潛伏期比Sham組明顯延長(P0.05);CIHH+ISH組的逃避潛伏期跟ISH組相比又出現(xiàn)了縮短了(P0.05);5-HD+CIHH+ISH組的逃避潛伏期比CIHH+ISH組延長(P0.05),5-HD+Sham組和Sham組無顯著差異。在空間探索實驗中,Sham組和CIHH組在原平臺所在象限停留時間占總時間百分比無差異;ISH組在目標(biāo)象限的停留時間百分比與Sham組相比明顯減少(P0.05);然而CIHH+ISH組與ISH組相比,在目標(biāo)象限的停留時間百分比明顯增加(P0.05);當(dāng)提前應(yīng)用了5-HD阻斷mito KATP后,在目標(biāo)象限的停留時間百分比又減少至接近ISH組水平(P0.05);5-HD+Sham組和Sham組無顯著差異。2硫堇染色顯示,Sham組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列整齊、致密,約2-3層,細胞結(jié)構(gòu)形態(tài)完整,邊界清晰,尼氏小體豐富,胞核大且圓、核仁清晰可見。CIHH組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元未見明顯損失,與Sham組相比,無明顯變化。ISH組大鼠海馬CA1區(qū)可見神經(jīng)元幾乎全部死亡,細胞結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生明顯改變,胞體縮小,形態(tài)不規(guī)則,呈多角形或梭型,胞膜皺縮,胞核固縮,核仁模糊不清甚至消失;CIHH+ISH組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列整齊、致密,胞核飽滿,核仁較清晰,僅有個別胞核固縮,無明顯細胞缺失。應(yīng)用5-HD后,組織學(xué)表現(xiàn)又接近ISH組。5-HD+Sham組和Sham組無顯著差異。3與Con組相比,CIHH處理28天后0h,6 h,1 d,3 d,7 d mito KATP的兩個亞基Kir6.2和SUR1的蛋白表達均顯著增高(P0.05),CIHH后10d無明顯差異。4 CIHH處理28天后2天或7天,與Sham組相比,CIHH組mito KATP的兩個亞基Kir6.2和SUR1的蛋白表達顯著增高(P0.05),與ISH組相比,CIHH+ISH組線粒體亞基Kir6.2和SUR1的蛋白表達顯著增高(P0.05)。5與Sham組相比,CIHH組大鼠海馬組織胞漿內(nèi)Cytochrome c明顯減少(P0.05),與ISH組大鼠相比,CIHH+ISH組大鼠胞漿內(nèi)Cytochrome c明顯減少(P0.05),與CIHH+ISH組大鼠相比,5-HD+CIHH+ISH組大鼠胞漿內(nèi)Cytochrome c明顯增多(P0.05),而線粒體內(nèi)的Cytochrome c的變化與胞漿內(nèi)相反。6與Sham組相比,ISH組ΔΨm的水平顯著降低(P0.05),與ISH組相比,CIHH+ISH組能明顯抑制ΔΨm的水平的降低,保持ΔΨm水平的穩(wěn)定(P0.05),與CIHH+ISH組相比,5-HD+CIHH+ISH組ΔΨm水平明顯降低(P0.05),說明5-HD取消了CIHH對ΔΨm水平降低的抑制作用。7與Sham組相比,CIHH組無明顯變化,ISH組中線粒體的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變,表現(xiàn)為廣泛的空泡化、嚴(yán)重的嵴斷裂以及伴有膜破壞;而CIHH+ISH組可部分改善線粒體的結(jié)構(gòu)變化,5-HD+CIHH+ISH組與CIHH+ISH相比,其線粒體又出現(xiàn)了明顯損傷,其表現(xiàn)與ISH組的線粒體超微結(jié)構(gòu)相似。結(jié)論:1 CIHH預(yù)處理可以誘導(dǎo)腦缺血耐受,減輕缺血造成的神經(jīng)元遲發(fā)性壞死、線粒體超微結(jié)構(gòu)損傷以及學(xué)習(xí)記憶的損傷。2 CIHH預(yù)處理上調(diào)了海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞的mito KATP的兩個亞基Kir6.2和SUR1的表達,并且對抗了腦缺血所致的兩個亞基表達的降低。3 CIHH可以對抗腦缺血時線粒體膜電位的下降和線粒體凋亡的啟動蛋白Cytochrome c的外流。4通過使用5-HD特異性阻斷mito KATP,驗證了mito KATP是通過上調(diào)其兩個亞基的蛋白表達和活性來參與CIHH誘導(dǎo)的腦缺血耐受的。
【圖文】：

1. Morris水迷宮實驗檢測各組大鼠的學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)功能結(jié)果。均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，，n=10。* P < 0.05 與假手術(shù)組相比，△P < IHH 組相比，#P < 0.05與ISH組相比，+P < 0.05與CIHH + ISH組相ig.1Spatial learning and memory ability conducted one month after isith the Morris water maze. Data are expressed as the mean ± SD, reach group.* P < 0.05 vs. Sham group,△P < 0.05 vs. CIHH group,#Ps. ISH group,+P < 0.05 vs. CIHH + ISH group.17

研 究 論 文圖2. 各組大鼠海馬CA1區(qū)的組織病理學(xué)變化的觀察。圖中最上方是硫堇染色圖片 (標(biāo)尺在圖a中為400 μm，b-g為 25 μm)。中間的點狀圖和最下方的柱形圖是組織學(xué)分級和神經(jīng)元密度。每個點代表一只動物，位置代表此動物的分級。數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，n=10。*P<0.05 vs sham組，# P<0.05 vs 缺血組，+P<0.05 vs CIHH+缺血組。Fig.2 Histological changes in the CA1 hippocampus area. The upper panels arerepresentative thionine-stained photomicrographs (scale bar is 400 um in a and25 um in b-g). The lower dot and bar graphs are quantitative presentations ofthe histological changes with histological grade and neuronal density. Each dotrepresents one animalassigned that grade. Data are expressed as the mean±SD,n = 10 for each group.* P < 0.05 vs. Sham group,#P < 0
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R743.3

【參考文獻】

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本文編號：2580210