本文選題：家蠶 + 滯育��； 參考：《西南大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：昆蟲是世界上數(shù)量最多、分布最廣的動(dòng)物,這與其驚人的適應(yīng)能力密不可分。滯育(diapause)便是昆蟲對(duì)環(huán)境適應(yīng)性的一個(gè)重要生理特性。滯育是指生物體受環(huán)境的誘導(dǎo),發(fā)育到某一階段停滯生長和發(fā)育以度過不良生活環(huán)境的一種生理狀態(tài)。滯育不同于休眠(dormancy),在滯育過程中,即使給予適宜的環(huán)境也不會(huì)即刻打破滯育而繼續(xù)發(fā)育,相反,適宜的環(huán)境正適于滯育狀態(tài)的維持。滯育對(duì)于昆蟲具有重大的意義:一方面度過不良的生存環(huán)境,使其生活周期與取食季節(jié)一致;另一方面,滯育解除后使種群發(fā)育齊一,可以提高雌雄交配機(jī)會(huì),利于種群的繁衍生存。因此,滯育在昆蟲的生存、繁衍和進(jìn)化過程中發(fā)揮著重要的作用。家蠶(Bombyx mori)作為重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲和優(yōu)秀的模式生物,其滯育現(xiàn)象一直是研究的熱點(diǎn)。對(duì)家蠶滯育的機(jī)制進(jìn)行研究,一方面為昆蟲滯育的研究提供理論基礎(chǔ);另一方面使研究成果應(yīng)用于蠶業(yè)實(shí)踐,以擴(kuò)大蠶業(yè)生產(chǎn),充分發(fā)揮其經(jīng)濟(jì)性狀;同時(shí),對(duì)于滯育機(jī)制的進(jìn)一步了解,還可以應(yīng)用于害蟲防治,對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境保護(hù)都具有重大意義。本研究立足于家蠶不同化性品系滯育性的不同,探究家蠶TrpA1基因?qū)Χ云废禍绊懙臋C(jī)制;同時(shí),利用數(shù)字表達(dá)譜測序篩選與家蠶滯育相關(guān)的差異表達(dá)基因并對(duì)差異基因進(jìn)行鑒定和功能驗(yàn)證。主要獲得如下研究結(jié)果:1.家蠶TrpA1基因的克隆及生物信息學(xué)分析為了探究BmTrpA1基因?qū)Σ煌云废禍杂绊懙臋C(jī)制,我們對(duì)BmTrpA1基因在家蠶三種化性品系中進(jìn)行了克隆,并對(duì)BmTrpA1基因編碼的蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。BmTrpA1基因的克隆結(jié)果顯示,所調(diào)查的三種化性家蠶品系在該基因的ORF框3360bp中有30處單堿基多態(tài)性,所編碼的氨基酸序列在一化、二化和多化性品系家蠶之間有三個(gè)氨基酸的差異。生物信息學(xué)分析表明,三種化性家蠶品系的bmtrpa1基因所編碼的蛋白結(jié)構(gòu)沒有差異。我們推測不同化性品系家響應(yīng)溫度調(diào)控子代滯育性差異的原因可能并不是bmtrpa1基因本身的序列結(jié)構(gòu)所致,而是因?yàn)閎mtrpa1基因調(diào)控序列的改變。2.家蠶trpa1基因在不同化性品系中胚胎期轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)分析為了探究bmtrpa1基因在不同化性品系中表達(dá)模式是否存在差異,我們利用qrt-pcr檢測每個(gè)品系胚胎期bmtrpa1基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示,bmtrpa1基因在一化性和多化性品系中,25℃和15℃暗催青條件下的整個(gè)胚胎期的表達(dá)量相近,表達(dá)模式相似;二化性品系中,在胚胎對(duì)溫度異常敏感的兩個(gè)時(shí)期即反轉(zhuǎn)期和點(diǎn)青期bmtrpa1基因在15℃暗催青條件下的表達(dá)量要高于25℃暗催青條件下的表達(dá)量,并且,bmtrpa1基因在15℃暗催青條件下出現(xiàn)表達(dá)高峰。由此我們推測bmtrpa1基因在二化性品系中通過改變表達(dá)模式參與調(diào)控二化性品系家蠶卵的滯育,而在一化性和多化性品系中不涉及家蠶卵滯育性的調(diào)控。3.不同化性品系家蠶trpa1基因上游序列重測序比對(duì)分析本實(shí)驗(yàn)選取了三種化性21個(gè)品系的家蠶以大造(dazao)基因組為參考基因組進(jìn)行bmtrpa1基因上游5kb(scaf23:3595057-3600057)序列的重測序比對(duì)分析。結(jié)果顯示snp位點(diǎn)主要集中于bmtrpa1基因上游scaf23:3596000-3597000這1kb范圍內(nèi)。隨后,通過genomatix網(wǎng)站預(yù)測這1kb序列的順勢(shì)調(diào)控原件,結(jié)果鑒定出61個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。其中包含一個(gè)熱激蛋白的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),是受溫度調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),此處發(fā)生單個(gè)核苷酸的變異就有可能涉及我們所研究的與溫度相關(guān)二化性家蠶滯育性的不同。這些變異位點(diǎn)的集合為我們進(jìn)一步探究bmtrpa1基因?qū)倚Q二化性品系滯育的調(diào)控作用提供了依據(jù)。4.家蠶二化性品系胚胎的數(shù)字基因表達(dá)譜測序及數(shù)據(jù)分析為了進(jìn)一步分析二化性家蠶品系響應(yīng)溫度調(diào)控子代滯育性狀的相關(guān)分子機(jī)制,我們?nèi)《云废礵azao在不同催青溫度(25℃/15℃)條件下發(fā)育至點(diǎn)青期的胚胎構(gòu)建了兩個(gè)文庫:25-hp(headpigmentation)和15-hp,進(jìn)行數(shù)字基因表達(dá)譜測序,并對(duì)測序數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)估與統(tǒng)計(jì)。分析結(jié)果顯示對(duì)樣本與參考基因組的比對(duì)、測序飽和度的檢測以及測序隨機(jī)性檢測的考量,都說明測序的質(zhì)量較高。同時(shí),對(duì)數(shù)字基因表達(dá)譜測序結(jié)果利用qrt-pcr進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,在滯育相關(guān)keggpathway中選取的19個(gè)基因中,有16個(gè)基因的表達(dá)情況都與測序結(jié)果具有一致性,這一結(jié)果說明了qrt-pcr和數(shù)字基因表達(dá)譜測序數(shù)據(jù)之間的一致性,表明測序結(jié)果可靠度較高,可以進(jìn)行后續(xù)的分析。同時(shí)測序結(jié)果顯示,兩個(gè)樣本比較共得到690個(gè)差異表達(dá)基因(fdr≤0.001and|log2ratio|≥1),其中有335個(gè)基因上調(diào)表達(dá),355個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。測序所得的差異表達(dá)基因中,其中434個(gè)基因參與了生物學(xué)進(jìn)程;263個(gè)基因參與了細(xì)胞組分;278個(gè)基因參與了分子功能。測序共富集到了203條KEGG pathway,其中在差異表達(dá)基因中顯著富集的pathway(Qvalue≤0.05)有29條。5.家蠶滯育相關(guān)基因的篩查鑒定與功能驗(yàn)證對(duì)家蠶二化性品系大造(Dazao)不同處理?xiàng)l件下的點(diǎn)青期胚胎進(jìn)行數(shù)字基因表達(dá)譜測序,經(jīng)過Gene Ontology以及KEGG Pathway分析,再結(jié)合文獻(xiàn)中對(duì)昆蟲滯育的研究結(jié)果,我們篩選到了period、timeless和takeout三個(gè)基因可能參與到二化性品系家蠶卵滯育的進(jìn)程。首先熒光定量PCR結(jié)果顯示period和takeout基因在家蠶一化性品系J106、二化性品系Dazao和多化性品系Nis中不同催青條件下整個(gè)胚胎期高表達(dá)時(shí),只有二化性Dazao中25℃催青條件下period和takeout基因的表達(dá)量明顯高于15℃催青條件下的表達(dá)量。基于以上發(fā)現(xiàn),我們進(jìn)一步推測period和takeout基因很可能參與二化性家蠶催青溫度對(duì)子代滯育性的調(diào)控。因此,利用RNAi實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證period和takeout基因在家蠶滯育方面的功能。首先合成了period和takeout基因的dsRNA,并對(duì)二化性家蠶品系Dazao低溫催青后,雌蛾產(chǎn)下的非滯育蠶卵(2h內(nèi))進(jìn)行注射,注射蠶卵在25℃條件下催青后飼喂直至化蛾產(chǎn)卵,結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射了period和takeout基因dsRNA后的蠶卵的子代仍然進(jìn)入了滯育。家蠶滯育是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控進(jìn)程,基于此結(jié)果,我們正在重復(fù)功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),利用基因編輯技術(shù)對(duì)period和takeout基因進(jìn)行敲除,并且對(duì)敲除結(jié)果進(jìn)行檢測,以便進(jìn)一步確定period和takeout基因?qū)Χ约倚Q響應(yīng)溫度調(diào)控子代卵滯育性的作用。
[Abstract]:On the other hand , the research results are as follows : 1 . The cloning of silkworm ' s TrpA1 gene is very important to the breeding and evolution of insects . The results showed that the sequence of gene expression profiles of silkworm ( Bombyx mori ) was significantly higher than that in the upstream 5 kb ( scaf23 : 3596000 - 3597000 ) sequence of silkworm ( Bombyx mori ) . We ' re repeating functional verification experiments , and using gene - editing techniques to knock out the period and Bombyx mori gene , and to detect knock - out results , so as to further determine the effect of the period and the transcriptional gene on the regulation of the response temperature of the secondary silkworm larvae .

【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q78

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本文編號(hào)：1855767