本文選題：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎　切入點(diǎn)：中性粒細(xì)胞　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：背景：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種自身免疫性疾病,它以滑膜炎、自身抗體、軟骨和骨破壞、系統(tǒng)性炎癥和損傷為特點(diǎn),有很高的發(fā)病率、致殘率、死亡率。全世界約有1%的人口患病。因?yàn)橛斜姸嗷颊唢柺躌A病痛的折磨,有必要不斷探尋新的更好的治療策略。在所有的參與RA發(fā)病的細(xì)胞中,中性粒細(xì)胞(polymorphonuclear leukocytes, PMNs)由于具有釋放多種降解酶和活性氧的能力,而擁有最強(qiáng)的細(xì)胞毒性潛能。RA這樣的炎癥性疾病的炎癥性微環(huán)境能使中性粒細(xì)胞的壽命延長到好幾天。這種壽命的延長使得中性粒細(xì)胞能夠在發(fā)生組成性凋亡或被巨噬細(xì)胞清除之前充分行使它們在炎癥反應(yīng)中的重要作用。近年來,中性粒細(xì)胞在各種系統(tǒng)性自身免疫性疾病中所起的作用引起了人們新的重視。但是,因?yàn)槿狈碜訰A患者的可用的人體組織,大多數(shù)的研究都是通過動物模型來進(jìn)行的,所以來自臨床RA患者的真實(shí)數(shù)據(jù)還不是很多。相對于獲取滑膜或關(guān)節(jié)標(biāo)本的困難性而言,外周血標(biāo)本更容易獲取并用于研究。外周血是一種高度動態(tài)的環(huán)境,它不停地在和體內(nèi)的幾乎每一個組織交換信息,能反映人體內(nèi)疾病的進(jìn)展情況。血液中的白細(xì)胞會和體內(nèi)幾乎每一個組織接觸并與之交流互動,它們攜帶了豐富的關(guān)于炎癥和免疫反應(yīng)的信息。在人體,中性粒細(xì)胞占循環(huán)中全部白細(xì)胞數(shù)量的60%,是含量最多的循環(huán)白細(xì)胞。目前關(guān)于中性粒細(xì)胞在RA發(fā)病中的作用值得更深入的研究。Caspase-1是參與自身免疫性疾病的公認(rèn)的一個重要因子。雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)caspase-1從RA患者發(fā)病的早期階段就存在過度活化,而且caspas e-1還被認(rèn)為是治療RA的一個潛在靶點(diǎn),但是caspase-1在RA疾病進(jìn)展中的作用仍然需要進(jìn)一步的研究探索。近來的研究已經(jīng)確定caspase-1的活化需要炎癥小體的形成。炎癥小體作為一個分子平臺可以介導(dǎo)caspase-1的活化,然后促使白介素1β(interleukin-1β, IL-1β)和白介素18 (interleukin-18, IL-18)成熟和釋放。NLRP3 (NOD-like receptor family, pyrin domain containing 3)炎癥小體是目前研究最多的炎癥小體之一�，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了它與多種疾病有關(guān)。在許多疾病機(jī)制的研究中都發(fā)現(xiàn)了由NLRP3炎癥小體引起caspase-1的活化,然而這一過程在RA疾病活動中的作用還有待研究。目的：在本研究中,我們主要調(diào)查NLRP3炎癥小體在RA發(fā)病中的作用,調(diào)查RA患者外周血中性粒細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的表達(dá)及其與疾病活動的關(guān)系。方法：1.收集48例RA患者和41例正常對照血液樣本和臨床資料。2.用Western blot方法檢測NLRP3炎癥小體組成成分的蛋白表達(dá)情況。3.用實(shí)時定量反轉(zhuǎn)錄PCR方法檢測NLRP3炎癥小體組成成分的mRNA達(dá)情況。4.用ELISA方法檢測NLRP3炎癥小體下游分子IL-1β和工L-18的血清水平。5.對NLRP3炎癥小體的表達(dá)、下游炎癥因子的水平、RA疾病活動的情況三者進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果：1.中性粒細(xì)胞與RA的疾病活動相關(guān)。RA患者外周血中性粒細(xì)胞計數(shù)與RA疾病活動度指數(shù)DAS28-CRP(r=0.3262,P=0.0171)和DAS28-ESR (r=0.3192, P=0.0186)正相關(guān)。RA患者的中性粒細(xì)胞中PR3的表達(dá)水平顯著高于對照組(P0.0001)。而且在RA患者內(nèi)部,疾病活動度指數(shù)DAS285.1的RA患者亞組中PR3的表達(dá)水平明顯高于DAS28≤5.1的RA患者亞組中PR3的表達(dá)水平(P0.0129)。2.與RA疾病活動度相關(guān)的是中性粒細(xì)胞中caspase-1的活化,而不是單核細(xì)胞中caspase-1的活化。在中性粒細(xì)胞中,活化的caspase-1蛋白顯著增加并與RA疾病活動度指數(shù)DAS28-ESR (r=0.4791, P=0.0178) 和DAS28-CRP (r=0.4252, P=0.0383)正相關(guān)。在PBMC中,活化的caspase-1與RA疾病活動度指數(shù)DAS28-ESR(r=0.1843,P=0.3885)和DAS28-CRP (r=0.1557, P=0.4677)無相關(guān)性。3.中性粒細(xì)胞中caspase-1的活化與血清IL-18正相關(guān),與IL-1 β無關(guān)。中性粒細(xì)胞中,活化的caspase-1蛋白水平與血清IL-18水平(r=0.6630,P=0.0005)正相關(guān),與IL-1 β水平(r=0.0782,P=0.7162)無關(guān)。4.與RA疾病活動度相關(guān)的是血清IL-18水平,而不是血清IL-1β水平。血清IL-18水平與關(guān)節(jié)壓痛(r=0.3637,P=0.0443)、關(guān)節(jié)腫脹(r=0.3717,P=0.0395), DAS28-ESR(r=0.4473, P=0.0150)、DAS28-CRP(r=0.4739, P=0.0094)等相關(guān)。血清IL-1 β水平與關(guān)節(jié)壓痛(r=0.1322,P=0.4783)、關(guān)節(jié)腫脹(r=-0.0345, P=0.8540)、DAS28-ESR (r=0.1714, P=0.3739)、DAS28-CRP(r=0.1680,P=0.3837)等沒有表現(xiàn)出相關(guān)性。5.RA患者中性粒細(xì)胞中caspase-1的活化是不依賴于NLRP3炎癥小體的。在RA患者中性粒細(xì)胞中NLRP3、ASC、pro-caspase-1的蛋白表達(dá)都比對照組明顯降低(P=0.0466 NLRP3; P=0.0017 ASC; P0.0001 pro-caspase-1), 但是活化的caspase-1的蛋白表達(dá)是明顯升高的(P=0.0022)。6. NLRP3 的 mRNA表達(dá)水平與RA疾病活動度負(fù)相關(guān)。(1)RA患者中性粒細(xì)胞中NLRP3和ASC的mRNA表達(dá)水平明顯下降(NLRP3 P 0.0001; ASC P=0.0011);而caspase-1的mRNA表達(dá)水平?jīng)]有變化(P=0.4467)。(2) NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA水平與相應(yīng)的NLRP3、ASC、pro-caspase-1蛋白水平相關(guān)。(3) NLRP3的mRNA表達(dá)水平和關(guān)節(jié)壓痛、關(guān)節(jié)腫脹、血沉、C反應(yīng)蛋白(r=-0.3241, P=0.0246)、DAS28-ESR、DAS28-CRP(r=-0.3212, P=0.0260)、 RF、anti-CCP等臨床參數(shù)負(fù)相關(guān)。(4)中性粒細(xì)胞中NLRP3的mRNA表達(dá)水平在DAS28-CRP較高的亞組(P=0.0258)和抗CCP抗體滴度較高的亞組(P=0.0197)中都是較低的。結(jié)論：RA患者中性粒細(xì)胞中caspase-1的過度活化介導(dǎo)了白介素18的成熟和釋放,從而促進(jìn)了RA的進(jìn)展,這一過程不依賴于NLRP3炎癥小體。背景：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是以對稱性、進(jìn)行性及侵蝕性關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的系統(tǒng)性自身免疫性疾病,會導(dǎo)致患者的不適、殘疾、藥物毒性、經(jīng)濟(jì)損失、死亡等后果。RA的發(fā)病機(jī)制至今尚未闡明。它的發(fā)生是遺傳背景、環(huán)境因素、自身免疫這三者共同作用所致,其中約60%危險因素來源于遺傳因素,遺傳因素在RA的發(fā)病中起了重要的作用。近年RA相關(guān)遺傳易感基因研究顯示,多種遺傳基因變異與RA發(fā)病相關(guān),其中最重要的是相關(guān)基因位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)。SNP主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一種,占所有已知多態(tài)性的90%以上。通過對SNP和RA相關(guān)性的研究,目前人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了約101個SNP位點(diǎn)與RA有關(guān)。NLRP3 (NLR family, pyrin domain containing 3),也稱NALP3 (NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 3)或隱熱蛋白(Cryopyrin),是 NLRPs蛋白家族中的典型代表。NLRP3可以和ASC (apoptosis-associated speck-like protein containing CARD)和caspase-1 (cysteine-aspartic acid protease 1),組成一種復(fù)合體—NLRP3炎性小體。隨后,活化的caspase-1催化白介素1β(IL-1β)和白介素18(IL-18)前體蛋白,形成活性形式并分泌釋放,引起各種免疫炎癥反應(yīng)。目前,NLRP3炎性小體在自身免疫和自身炎癥等病理過程中的作用及意義備受關(guān)注。NLRP3基因,也稱PYPAF1或CIAS1基因,定位于染色體1q44,其編碼的蛋白產(chǎn)物就是前述的NLRP3蛋白。本研究關(guān)注的NLRP3 p.Q705K (rs35829419)突變是一種錯義突變,也是一種功能獲得性突變,NLRP3基因中Q705K基因變異可使NLRP3蛋白自身發(fā)生改變而激活,從而使IL-1β及IL-18前體蛋白的成熟和釋放增高。CARD8 (caspase recruitment domain family member 8)蛋白,也稱為TUCAN (Tumor up-regulated CARD-containing antagonist of CASP9)或CARDINAL (CARD-inhibitor of NF-kappa-B-activating ligand)天冬酶(caspases)的活化和核因子kappa-B (NF-κB)的活化,參與凋亡和炎癥過程。此外,CARD8也參與組成炎癥小體,進(jìn)而通過活化caspase-1進(jìn)而催化IL-1β和IL-18前體蛋白成熟形成活性形式并分泌,引起各種免疫炎癥反應(yīng)。CARD8基因定位于染色體19q13.33。CARD8p.C10X (rs2043211)突變是一種終止突變,產(chǎn)生一個提前終斷的殘缺蛋白。CARD8p.C10X單核苷酸多態(tài)性已被報道與RA的活動性及嚴(yán)重程度相關(guān)。聯(lián)合分析不同基因位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性可以有助于發(fā)現(xiàn)單個基因位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性不能解釋的遺傳易感性。同時攜帶NLRP3 p.Q705K突變和CARD8p.C10X突變的攜帶者表現(xiàn)出更高的炎癥小體活性,更易出現(xiàn)免疫反應(yīng)。本研究通過對有關(guān)研究中對RA群體的NLRP3 p.Q705K和CARD8 p. C10X單核苷酸多態(tài)性研究的結(jié)果進(jìn)行Meta分析,探討它們與RA易感性的關(guān)聯(lián)及關(guān)聯(lián)強(qiáng)度。目的：1.通過Meta分析,確定NLRP3 p. Q705K單核苷酸多態(tài)性是否與RA的易感性之間有關(guān)系。2.通過Meta分析,確定CARD8 p. C10X單核苷酸多態(tài)性是否與RA的易感性之間有關(guān)系。3.通過Meta分析,確定NLRP3 p. Q705K和CARD8 p. C10X的聯(lián)合多態(tài)性是否與RA的易感性之間有關(guān)系。4.通過Meta分析,確定是否NLRP3 p.Q705K位點(diǎn)至少有一個突變型等位基因同時CARD8 p. C10X位點(diǎn)也至少有一個突變型等位基因的基因型比兩個位點(diǎn)同時為純合野生型的基因型更易患RA。方法：1.文獻(xiàn)檢索：用數(shù)據(jù)庫和網(wǎng)絡(luò)資源檢索篩選文獻(xiàn)信息。檢索范圍包括：中文數(shù)據(jù)庫：相關(guān)期刊論文(CJFD)、中外標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(WFSD)、中文科技期刊數(shù)據(jù)庫(CSJD)、中國生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(CBM)；外文數(shù)據(jù)庫：PubMed、Cochrane library、EMBase、Elsevier science direct (SD)、Web of science、SpringerLink。2.文獻(xiàn)篩選與質(zhì)量評價：按照事先制定好的文獻(xiàn)納入與排除標(biāo)準(zhǔn)篩選文獻(xiàn)。用Newcastle-Ottawascale(NOS)文獻(xiàn)質(zhì)量評價量表評價納入的研究的質(zhì)量。3.數(shù)據(jù)及相關(guān)信息的提�。禾崛∥墨I(xiàn)的第一作者、發(fā)表時間、國家、期刊,種族,語言,疾病,診斷的確定,對照來源,研究人口學(xué)特征,基因型頻率,哈德溫平衡檢驗(yàn),基因檢測方法等信息。4.統(tǒng)計分析：使用統(tǒng)計軟件STATA12.0 (Stata Corporation, College Station, TX,USA)。統(tǒng)計分析效應(yīng)量采用目的基因單核苷酸多態(tài)性在病例組和對照組發(fā)生的優(yōu)勢比OR (odds ratio)�？傮w效應(yīng)的統(tǒng)計學(xué)評估采用Z檢驗(yàn)。分別以等位基因(Mallele vs W allele)、基因型(MM vs WW、MM vsWM、WM vs WW)、顯性模型(MM+MW vs WW)、隱形模型(MM vs MW+WW)等來合并OR值。5.異質(zhì)性分析：異質(zhì)性檢驗(yàn)用Cochran Q檢驗(yàn)(P0.05有統(tǒng)計學(xué)意義),同時計算工2值。當(dāng)有統(tǒng)計學(xué)意義的異質(zhì)性存在,即P0.05或者I250%時,采用隨即效應(yīng)模型,否則采用固定效應(yīng)模型。6.敏感性分析：敏感性分析用于判斷去除某一研究是否會影響總體效應(yīng)。7.發(fā)表偏倚分析：采用Begg法和Egger法檢驗(yàn)發(fā)表偏倚對Meta分析結(jié)果的影響。結(jié)果：1.文獻(xiàn)檢索結(jié)果：檢出文獻(xiàn)44篇,納入5篇。2.被納入的研究情況：5篇病例對照研究發(fā)表于2007年至2015年,包含2705例RA患者,2711例正常對照。3.納入研究的質(zhì)量評價：用Newcastle-Ottawa scale (NOS)文獻(xiàn)質(zhì)量評價量表,納入的5篇文獻(xiàn)中有1篇得6顆星,3篇得7顆星,1篇得8顆星。4. NLRP3 p. Q705K單核苷酸多態(tài)性Meta分析結(jié)果：對納入的研究進(jìn)行異質(zhì)性檢驗(yàn),各研究間無明顯異質(zhì)性,采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行Meta分析。結(jié)果提示NLRP3 p. Q705K基因多態(tài)性與RA的發(fā)生無統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性(P0.05)。剔除掉不符合不符合Hardy-Weinberg平衡的研究后,NLRP3 rs35829419基因多態(tài)性與RA的發(fā)生仍無統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性(P0.05)。5. CARD8 p. C10X單核苷酸多態(tài)性Meta分析結(jié)果：對納入的研究進(jìn)行異質(zhì)性檢驗(yàn),各研究間無明顯異質(zhì)性,采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行Meta分析。結(jié)果提示C ARD8 p.C10X基因多態(tài)性與RA的發(fā)生無統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性(P0.05)。6. NLRP3 p. Q705K 和CARD8 p. C10X聯(lián)合多態(tài)性Meta分析結(jié)果：(1)選取CARD8/NLRP3 AA/CC的組合作為參照,其他的各種組合與之對比。Meta分析結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)任何一種組合的0R值有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(2)把NLRP3 p. Q705K位點(diǎn)至少有一個突變型等位基因(基因型AA或CA)同時CARD8 p.C10X位點(diǎn)至少有一個突變型等位基因(基因型AA或TA)的基因型合并成一組,把NLRP3 p. Q705K位點(diǎn)野生型基因型CC同時CARD8 p. C10X位點(diǎn)野生型基因型TT合并成一組,然后把納入研究中比較兩組與RA的相關(guān)性的結(jié)果進(jìn)行Meta分析。異質(zhì)性檢驗(yàn)的結(jié)果卡方值7.58,P=0.056,,%=60.4%。采用隨機(jī)效應(yīng)模型計算,并分別用人口分層和方法學(xué)分層兩種分層方法來進(jìn)行異質(zhì)性來源的探索。按人口分層,各亞組的結(jié)果和總體的結(jié)果沒有不一致,而按照方法學(xué)分層,使用SNuPe法的亞組結(jié)果[OR=2.178,95%CI(1.085,4.373),P=0.029]；與總體結(jié)果[OR=1.056,95% CI (0.545,2.046), P=0.872]明顯不同,可見異質(zhì)性主要來自于基因檢測的方法不同。敏感性分析發(fā)現(xiàn)盡管存在一定程度上的方法學(xué)異質(zhì)性,剔除掉任意一部分研究數(shù)據(jù)都沒有能夠?qū)傮w結(jié)論產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性的影響。結(jié)論：1.NLRP3 p.Q705K基因多態(tài)性與RA的發(fā)生仍無統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性。2.CARD8 p.C10X基因多態(tài)性與RA的發(fā)生無統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性。3. NLRP3 p. Q705K 和CARD8 p. C10X的聯(lián)合多態(tài)性與RA的發(fā)生無統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性。4.還不能認(rèn)為NLRP3 p. Q705K位點(diǎn)至少有一個突變型等位基因同時CARD8 p. C10X位點(diǎn)也至少有一個突變型等位基因的基因型比兩個位點(diǎn)同時為純和野生型的基因型更易患RA。RA是一個多基因遺傳背景與環(huán)境相互作用的疾病。多種遺傳因素與多種環(huán)境因素交織在一起,使得RA患者群體內(nèi)部就存在有明顯的異質(zhì)性,正因?yàn)檫@種復(fù)雜性,RA具體的機(jī)制一直沒有完全闡述清楚。我們通過Meta分析證實(shí),NLRP3 p.Q705K和CARD8 p.C10X單核苷酸多態(tài)性與RA的易感性無關(guān),但是不排除他們與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度有關(guān)的可能性,這還需要更多的實(shí)驗(yàn)研究。目的：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種系統(tǒng)性炎癥性疾病。血小板增多和貧血都是RA患者常見的關(guān)節(jié)外表現(xiàn),反映了RA患者體內(nèi)血小板和血紅蛋白發(fā)生的異常。本研究首次調(diào)查血小板與血紅蛋白的比值(PHR)這樣一個新的指標(biāo)在反映RA患者系統(tǒng)性炎癥和疾病活動度的價值。方法：本研究納入了250例RA患者和100例健康對照者。RA患者的疾病活動度分別用基于血沉和C反應(yīng)蛋白的28個關(guān)節(jié)疾病活動度指數(shù)DAS28-ESR和DAS28-CRP來計算。統(tǒng)計分析PHR值與DAS28值之間的線性關(guān)系。同時也分析PHR值與RA患者系統(tǒng)性炎癥指標(biāo)以及心血管病相關(guān)的指標(biāo)之間的關(guān)系。在一組RA患者中觀察治療前后PHR值的變化,評估PHR對治療的反應(yīng)性。結(jié)果：與正常對照比較,RA患者的血小板水平明顯增高(P0.001)而血紅蛋白的水平明顯降低(P0.001)。與正常對照比較,RA患者的PHR值明顯增高(P0.001),并與DAS28-ESR(r=0.411,P0.001)和DAS28-CRP(r=0.359,P0.001)顯著正相關(guān)。此外,RA患者的PHR值與血清白介素6、血沉、C反應(yīng)蛋白、白球比、免疫球蛋白G、補(bǔ)體C3等系統(tǒng)性炎癥指標(biāo)均有顯著相關(guān)性(P均0.01)。此外,RA患者的PHR值還與已知的心血管病危險預(yù)測因子-血清唾液酸水平正相關(guān)(P0.001),與心血管疾病保護(hù)因子-超氧化物歧化酶、總膽紅素、載脂蛋白A-I等負(fù)相關(guān)(P均0.001)。與治療前相比,經(jīng)過有效的治療以后RA患者的升高的PHR值得到了明顯的糾正(P0.01)。結(jié)論：PHR是一個新穎的指標(biāo),能夠反映RA患者的系統(tǒng)性炎癥和疾病活動度水平,并在預(yù)測心血管疾病和療效評價方面具有潛在的應(yīng)用價值。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R593.22
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本文編號：1704092