本文選題：食管鱗狀細(xì)胞癌　切入點：高遷移率族蛋白A2(high　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景食管癌在我國乃至世界范圍內(nèi)都是發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一,其病理組織學(xué)分類多樣,例如鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、未分化癌等,但以下面兩種最為多見：食管腺癌、食管鱗狀細(xì)胞癌。食管癌在我國本身就高發(fā),再加上我國人口基數(shù)大,每年新發(fā)病例便多,約占全世界新發(fā)病例的半數(shù)左右,而且可能由于遺傳、飲食習(xí)慣等原因病理組織學(xué)類型分布與歐美不同,其中食管鱗狀細(xì)胞癌占絕對多數(shù),約占食管癌的90%,造成了極大的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)和社會負(fù)擔(dān)。隨著內(nèi)鏡技術(shù)的發(fā)展,有不少食管鱗狀細(xì)胞癌能夠在非常早期便被發(fā)現(xiàn),從而通過內(nèi)鏡下食管粘膜剝離術(shù)治療,另外胸中段食管癌占據(jù)多數(shù),分期稍晚的但是有外科手術(shù)機會的患者多以進(jìn)行食管癌根治術(shù)+胸腹兩野淋巴結(jié)清掃術(shù)為主,但內(nèi)鏡下食管粘膜剝離術(shù)無法對淋巴結(jié)進(jìn)行清掃,而食管癌根治術(shù)+胸腹兩野淋巴結(jié)清掃術(shù)無法對可能隱匿的頸部淋巴結(jié)進(jìn)行清掃,術(shù)后容易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā),還有很多患者發(fā)現(xiàn)時便已錯過手術(shù)機會,總體5年生存率很低。近些年來,隨著科技和社會的進(jìn)步,分子靶向治療越來越顯示出優(yōu)勢,在一些惡性腫瘤的治療方面起到了很好的作用。例如應(yīng)用索拉菲尼對肝癌進(jìn)行治療和應(yīng)用易瑞沙對肺癌進(jìn)行治療,極大的改善了腫瘤患者的預(yù)后。與食管鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)的基因及其產(chǎn)物,在近些年研究的也比較多,但到目前為止,仍然沒有能得到臨床公認(rèn)并廣泛應(yīng)用的指標(biāo)。鑒于以上幾點原因,我們認(rèn)為繼續(xù)尋找在食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生及進(jìn)展過程中有重要作用的因子,并研究其作用機制,可能帶來兩方面益處：一是如果能夠提示某些患者預(yù)后差的話可以制定個體化治療,例如術(shù)后聯(lián)合放療,另外如果某些基因及產(chǎn)物對癌細(xì)胞的擴散有幫助的話可以針對其研究藥物進(jìn)行精準(zhǔn)治療。高遷移率族蛋白A2,簡稱HMGA2,是一種非組蛋白染色體蛋白,能夠通過改變脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)的結(jié)構(gòu)來調(diào)節(jié)某些基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá),作用方式是通過AT-hook結(jié)構(gòu)域與DNA結(jié)合,因此又被稱為“構(gòu)筑轉(zhuǎn)錄因子”。研究發(fā)現(xiàn)HMGA2與機體的生長發(fā)育密切相關(guān),在胚胎早期高表達(dá),而在正常成人分化成熟的組織中幾乎檢測不出。近年來,多項研究發(fā)現(xiàn)在一些良惡性腫瘤中存在HMGA2的異常表達(dá),并且HMGA2表達(dá)增高往往預(yù)示著該腫瘤容易轉(zhuǎn)移和浸潤,預(yù)后差。隨之進(jìn)一步的細(xì)胞學(xué)研究發(fā)現(xiàn)抑制HMGA2的表達(dá)后腫瘤細(xì)胞的增殖速度減慢,侵襲能力減弱。以上這些研究提示HMGA2可能在腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展過程中發(fā)揮一定的作用。食管鱗狀細(xì)胞癌做為一種常見惡性腫瘤,HMGA2的表達(dá)如何,抑制HMGA2表達(dá)后食管鱗狀細(xì)胞癌癌細(xì)胞的增殖速度及侵襲能力會有怎樣的變化,目前尚沒有系統(tǒng)的研究報道。所以我們設(shè)計了此項研究,首先對食管鱗狀細(xì)胞癌及癌旁組織中HMGA2的表達(dá)情況進(jìn)行檢測,方法包括Western Blot及免疫組織化學(xué)法,其次將癌組織中HMGA2檢測結(jié)果結(jié)合患者的臨床病理資料及隨訪資料進(jìn)行分析,尋找與食管鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后相關(guān)的因素,然后通過慢病毒轉(zhuǎn)染及RNA干擾的方法抑制HMGA2的異常表達(dá),將HMGA2受到抑制的細(xì)胞進(jìn)行CCK-8法細(xì)胞增殖實驗及transwell實驗,從而研究HMGA2對食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力的影響,以期為食管鱗狀細(xì)胞癌的分子靶向治療提供一個可供選擇的靶點。第一部分食管鱗狀細(xì)胞癌組織中HMGA2的表達(dá)檢測及其與患者臨床和病理特點之間的相關(guān)性研究目的：檢測食管鱗狀細(xì)胞癌患者的癌組織中是否有HMGA2的異常表達(dá),及HMGA2異常表達(dá)與患者臨床特點和病理特點之間的相關(guān)性。方法：在這部分實驗中,我們根據(jù)入選標(biāo)準(zhǔn)對自2007年10月至2009年9月在山東省立醫(yī)院胸外科住院并接受經(jīng)右胸上腹二切口食管癌切除+胃食管右胸頂吻合術(shù)(Ivor-Lewis)的胸中段食管鱗狀細(xì)胞癌患者進(jìn)行篩選,最終有127例患者達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)成為研究對象,對以上患者的術(shù)后標(biāo)本進(jìn)行收集,每位患者留取的標(biāo)本均包括食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)組織及相應(yīng)的健康食管粘膜(corresponding healthy esophageal mucosa, CHEM)組織,對兩組標(biāo)本進(jìn)行HMGA2表達(dá)情況檢測,方法包括蛋白質(zhì)免疫印跡(WB)和免疫組織化學(xué)(IHC)方法,將檢測結(jié)果進(jìn)行比較。再通過統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS19.0將食管鱗狀細(xì)胞癌組織中HMGA2表達(dá)情況與患者的年齡、性別、腫瘤長度、T分期、組織分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況用卡方檢驗的方法進(jìn)行相關(guān)性分析。P0.05時認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果：進(jìn)行免疫組織化學(xué)法檢測時,從顯微鏡下觀察,當(dāng)細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕色顆粒認(rèn)為有HMGA2表達(dá)。免疫組化評分≥4的樣本認(rèn)為有HMGA2陽性表達(dá)。檢測結(jié)果顯示HMGA2陽性表達(dá)率在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中是63.3%(72/127),在相應(yīng)的健康食管粘膜組織中無陽性表達(dá),兩組相比有顯著差異。卡方檢驗相關(guān)性分析顯示與HMGA2陽性表達(dá)有相關(guān)性的臨床及病理特點包括：組織分化程度(P=0.008),T分期(代表浸潤深度)(P=0.007),是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P0.001)、TNM分期(P=0.006)；無相關(guān)性的臨床及病理特點包括：性別(P=0.291)、年齡(P=0.857)及病變長度(P=0.854)。進(jìn)一步的蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測顯示HMGA2的陽性表達(dá)率在Ⅲ期和Ⅳ期患者癌組織中顯著高于Ⅰ期和Ⅱ期患者癌組織。結(jié)論：食管鱗狀細(xì)胞癌中有HMGA2的高表達(dá),且與HMGA2表達(dá)增高相關(guān)的臨床及病理特點包括：組織分化程度、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及T分期(代表浸潤深度),HMGA2可能與食管鱗狀細(xì)胞癌的浸潤能力及臨床進(jìn)展相關(guān)。第二部分影響食管鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的相關(guān)因素分析目的：研究影響食管鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的相關(guān)因素中是否包括HMGA2的表達(dá)。方法：本部分實驗中,研究對象仍為2007年10月至2009年9月在山東省立醫(yī)院胸外科住院并接受經(jīng)右胸上腹二切口食管癌切除+胃食管右胸頂吻合術(shù)(Ivor-Lewis)的胸中段食管鱗狀細(xì)胞癌患者,通過對患者術(shù)后進(jìn)行定期的隨訪觀察,記錄生存時間。統(tǒng)計軟件采用SPSS19.0,統(tǒng)計方法包括應(yīng)用Kaplan-Meier生存曲線繪制總體的生存曲線及HMGA2不同表達(dá)組的生存曲線,將收集的臨床資料、病理特點以及HMGA2表達(dá)情況均進(jìn)行Log-rank檢驗篩選出與生存時間相關(guān)的因素,再通過Cox回歸分析最終篩選出影響患者生存時間的獨立危險因素。P值0.05時認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果：結(jié)果顯示總體5年生存率是19.69%。HMGA2表達(dá)陽性組和HMGA2表達(dá)陰性組5年生存率差異顯著(13.89%vs.27.27%,P0.001)。通過Log-rank檢驗得出與生存時間相關(guān)的因素還包括：TNM分期、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及組織分化程度。將以上四項進(jìn)行Cox回歸多因素分析后顯示影響食管鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的獨立危險因素包括：腫瘤TNM分期(P=0.006),組織學(xué)分化程度(P=0.003)和HMGA2表達(dá)水平(P=0.048)。結(jié)論：影響食管鱗狀細(xì)胞癌患者術(shù)后5年生存率的獨立危險因素包括：腫瘤組織學(xué)分化程度、TNM分期及HMGA2表達(dá)水平。第三部分應(yīng)用RNAi沉默技術(shù)觀察HMGA2基因?qū)κ彻荀[狀細(xì)胞癌Eca109細(xì)胞生物學(xué)行為的影響目的：應(yīng)用RNAi沉默技術(shù)研究HMGA2對食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Eca109細(xì)胞增殖速度和侵襲能力的影響。方法：在本部分的實驗研究中,首先對食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Eca109中HMGA2的表達(dá)情況進(jìn)行檢測,方法包括定量即時聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)和蛋白質(zhì)免疫印跡法,再通過攜帶HMGA2shRNA的慢病毒和攜帶NCshRNA的慢病毒分別轉(zhuǎn)染食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Eca109,從而將細(xì)胞系分為三組：HMGA2組、NC組、空白對照組,分別通過定量即時聚合酶鏈反應(yīng)和蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測三組中HMGA2mRNA和HMGA2蛋白,驗證HMGA2組細(xì)胞系中HMGA2的表達(dá)確實被抑制后進(jìn)一步通過細(xì)胞功能學(xué)實驗CCK-8法和trans well法來觀察抑制HMGA2表達(dá)后食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Eca109細(xì)胞的增殖速度和侵襲能力變化。結(jié)果：定量即時聚合酶鏈反應(yīng)和免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)果均顯示HMGA2在食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Eca109中表達(dá)增高。應(yīng)用RNA干擾技術(shù)和慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)可以成功構(gòu)建HMGA2表達(dá)的Eca109細(xì)胞系,而且該細(xì)胞系可以穩(wěn)定傳代,與其它兩組比較,CCK-8法實驗顯示HMGA2表達(dá)被抑制后癌細(xì)胞的增殖速度減慢,transwell實驗顯示HMGA2表達(dá)被抑制后癌細(xì)胞的侵襲能力減弱。結(jié)論：食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Eca109細(xì)胞中HMGA2的表達(dá)可以通過攜帶HMGA2shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染來被特異性抑制,HMGA2表達(dá)被抑制后細(xì)胞的增殖速度減慢,侵襲能力減弱。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1699207