本文關(guān)鍵詞： 帕金森病 神經(jīng)退行性疾病 神經(jīng)炎癥 藍(lán)斑核 去甲腎上腺素 小膠質(zhì)細(xì)胞 NADPH氧化酶 DSP-4 脂多糖內(nèi)毒素 氯氮平-N-氧化物　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究目的帕金森病(Parkinson's disease, PD)是第二大最常見的神經(jīng)變性疾病,特征表現(xiàn)為進(jìn)行性運動障礙,包括靜止震顫,肌強直,運動遲緩,和步態(tài)不穩(wěn)等癥狀。當(dāng)前全球大約有700萬人患有帕金森病。在中國,帕金森病的患病率在65歲以上人群中大約是2.05%。帕金森病給社會和患者家庭帶來巨大的經(jīng)濟和生活負(fù)擔(dān)。據(jù)報導(dǎo),在美國每名帕金森病患者每年的醫(yī)療費用大概在10,000美元。除了經(jīng)濟成本,帕金森病的運動和非運動癥狀都大大降低PD病人及其照顧者的生活質(zhì)量。帕金森病的確切病因尚不清楚。帕金森在大多數(shù)患者都是特發(fā)性的。帕金森病的已知病因包括遺傳,環(huán)境因素等,或者是兩者的共同作用。流行病學(xué)研究表明,帕金森病患者中僅有不足10%與家族遺傳因素相關(guān),而超過90%的PD患者都是散發(fā)的。目前,帕金森病尚缺乏有效的治療手段�？傻玫闹委煼桨复蠖酁閷ΠY治療,包括補充左旋多巴,多巴胺激動劑和MAO-B抑制劑等。但這只能緩解癥狀,并不能阻斷或逆轉(zhuǎn)疾病的發(fā)展。帕金森病的主要病理變化包括多巴胺能神經(jīng)元變性,Lewy體形成和紋狀體多巴胺減少等,這些病理變化的共同特征是慢性、漸進(jìn)性、不可逆的改變。正常人中,大腦黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元隨著人體老化過程也會有少量減少,大約不超過10%-15%,但并不會出現(xiàn)帕金森病癥。大部分PD患者被確診時,多巴胺能神經(jīng)元的損失已經(jīng)達(dá)到60%以上。對于帕金森病的疾病進(jìn)展過程的研究,雖然黑質(zhì)紋狀體通路仍然是主要焦點,但隨著病人尸檢結(jié)果和MRI技術(shù)應(yīng)用等,早有研究表明,中腦-皮質(zhì),皮質(zhì)-邊緣通路在疾病進(jìn)程中也發(fā)揮了重要作用。除了多巴胺能神經(jīng)元投射系統(tǒng),膽堿能神經(jīng)元,γ-氨基丁酸能神經(jīng)元,和去甲腎上腺素能神經(jīng)元投射系統(tǒng)也發(fā)生明顯病理改變,包括神經(jīng)元減少、Lewy體形成及神經(jīng)遞質(zhì)減少等。2003年,德國病理學(xué)家Braak博士根據(jù)其在病人標(biāo)本和尸檢中α突觸核蛋白染色等結(jié)果,提出著名的Braak“黑匣子理論”,認(rèn)為PD不僅是運動障礙疾病,一系列的非運動癥狀在疾病早期,運動癥狀出現(xiàn)之前,即已發(fā)生,同時伴隨有自腦干向中腦、皮質(zhì)區(qū)自下而上發(fā)生神經(jīng)元退行性變。Braak理論一經(jīng)提出,就引起同行專家的廣泛關(guān)注,帕金森病的發(fā)病起點、疾病進(jìn)展因素、運動癥狀前非運動癥狀(包括嗅覺減退、胃腸功能失調(diào)、睡眠紊亂、焦慮-抑郁病癥等)成為帕金森病研究新的關(guān)注焦點和研究方向。多項研究證實,帕金森病疾病進(jìn)展中,腦干區(qū)域藍(lán)斑核(Locus Coeruleus, LC)的去甲腎上腺素能神經(jīng)元(Norepinephrine, NE)損失發(fā)生明顯早于中腦黑質(zhì)區(qū)域(Substantia Nigra, SN)的多巴胺能神經(jīng)元,時間差大約要早10-15年。而且,藍(lán)斑核神經(jīng)元的減少很可能與帕金森病人的運動癥狀前出現(xiàn)的非運動癥狀有關(guān),包括嗅覺減退、焦慮-抑郁癥狀、胃腸功能紊亂、睡眠障礙等。然而,對帕金森病早期階段的病理改變和非運動癥狀的進(jìn)一步研究一直停滯不前,原因是缺乏一個可利用的有效的動物模型。我們實驗室先前的研究已經(jīng)建立一個神經(jīng)炎性誘導(dǎo)的帕金森病模型,該模型可以模擬帕金森病中黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元的慢性、漸進(jìn)性病理改變和運動癥狀的延遲性、進(jìn)展性出現(xiàn)。該小鼠模型是利用細(xì)菌內(nèi)毒素腹腔注射,引起全身炎性反應(yīng),血液中高濃度的腫瘤壞死因子TNF-a被攜帶進(jìn)入大腦,引起小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和持續(xù)性反饋激活,從而引起神經(jīng)元變性死亡和疾病發(fā)生。然而,我們知道,帕金森病的神經(jīng)元變性和癥狀改變已經(jīng)不僅僅限于黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的變性和運動障礙的出現(xiàn)。確定其他相關(guān)腦區(qū),藍(lán)斑核、海馬、前皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元的改變也至關(guān)重要。因此,在本研究中,我們不僅觀察黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元的改變,焦點更主要在炎性模型是否能夠模擬帕金森病中實際發(fā)生的自下而上多個腦區(qū)漸進(jìn)性神經(jīng)元的變性和死亡。并試圖由此揭示最早發(fā)生神經(jīng)元變性的藍(lán)斑核去甲腎上腺素能神經(jīng)元在疾病進(jìn)展中所扮演的角色。因此,該課題在細(xì)菌內(nèi)毒素誘導(dǎo)的帕金森病神經(jīng)炎性模型中,我們最早觀察腦干區(qū)藍(lán)斑核去甲腎上腺素能神經(jīng)元的改變,這對于帕金森病的早期診斷和治療具有重要意義。本項研究的主要目的為,確定炎癥介導(dǎo)的嚙齒動物帕金森病模型是否可以模擬帕金森病人中發(fā)生的自下而上漸進(jìn)性神經(jīng)元變性死亡和運動、非運動癥狀的出現(xiàn),闡明藍(lán)斑核去甲腎上腺素在疾病進(jìn)展中的作用,并揭示發(fā)生這一慢性漸進(jìn)性神經(jīng)元變性的細(xì)胞和分子機制。我們的研究假設(shè)是,較早發(fā)生的藍(lán)斑核去甲腎上腺素能神經(jīng)元變性死亡啟動和促進(jìn)了帕金森病的發(fā)生和進(jìn)展。我們的研究的目標(biāo)包括：1)確定炎癥介導(dǎo)的嚙齒動物PD模型中是否發(fā)生自下而上、有序的漸進(jìn)性神經(jīng)元的缺失,尤其是藍(lán)斑核去甲腎上腺素能神經(jīng)元；2)確定較早發(fā)生的藍(lán)斑核去甲腎上腺素能神經(jīng)元死亡和去甲腎上腺素缺失是否與其投射區(qū)的神經(jīng)元變性死亡有關(guān)；3)建立一個合適的帕金森病模型能夠同時出現(xiàn)帕金森病的運動和非運動癥狀；4)闡明藍(lán)斑核去甲腎上腺素如何調(diào)節(jié)炎癥介導(dǎo)的神經(jīng)退行性病變的機制。5)根據(jù)以上研究結(jié)果,發(fā)展新的帕金森病靶向治療方案。研究方法1.小鼠動物模型：根據(jù)不同實驗?zāi)康脑O(shè)計實驗方案,6-8周齡雄性C57BL/6小鼠腹腔注射LPS (5 mg/kg.bw)或DSP-4 (50 mg/kg.bw)或先后聯(lián)合注射。在設(shè)定的時間點(分別在注射之后的第1,2,4,7,10,12個月),從各組取5-8只小鼠實施安樂死,并取出大腦后固定在4%多聚甲醛中4℃過夜。然后大腦置于30%蔗糖/PBS溶液中4℃保存,直至大腦下沉到容器的底部。作冠狀切面冰凍切片,收集含藍(lán)斑核的腦干,含黑質(zhì)、海馬的中腦,以及大腦皮質(zhì)區(qū)的35μm厚度組織切片。2.免疫組織化學(xué)染色：用4-10%山羊血清和1%BSA在triton-100/PBS溶液中封閉,然后與多克隆兔抗TH抗體(1：2000-5000稀釋),或NeuN抗體(1：1000稀釋度)4℃下作用48小時。使用Vectastain ABC試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺基染色顯示細(xì)胞或免疫熒光染色共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和病理改變。3.細(xì)胞計數(shù)：在黑質(zhì)致密部TH免疫反應(yīng)(THIR)神經(jīng)元的數(shù)目是由立體計數(shù)系統(tǒng)軟件進(jìn)行統(tǒng)計。該軟件使用系統(tǒng)地隨機化的黑質(zhì)區(qū)域定義的邊界之內(nèi)無偏計數(shù)幀(100微米×100微米)的光學(xué)分餾方法計數(shù)估算。經(jīng)DAB染色的NeuN免疫反應(yīng)性神經(jīng)元和Iba-1小膠質(zhì)細(xì)胞或經(jīng)免疫雙熒光染色的神經(jīng)元或細(xì)胞是由ImageJ軟件進(jìn)行自動計數(shù)。4.腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)檢測：大腦皮質(zhì),海馬,尾殼核,中腦和腦干中去甲腎上腺素、多巴胺、5-羥色胺等神經(jīng)遞質(zhì)及其主要代謝物的含量水平經(jīng)高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行檢測。5.大腦各區(qū)炎癥因子或標(biāo)志蛋白：mRNA含量檢測：應(yīng)用實時定量PCR進(jìn)行冰凍組織中炎癥因子或標(biāo)志蛋白mRNA含量檢測,簡言之,用RNeasy Mini試劑盒(Qiagen)提取和收集大腦皮質(zhì),海馬,尾殼核,中腦和腦干組織中mRNA,并經(jīng)反轉(zhuǎn)錄為cDNA,使用SYBR green PCR混合液進(jìn)行標(biāo)記,應(yīng)用7900HT快速實時PCR系統(tǒng)根據(jù)制造商的方案進(jìn)行實時PCR擴增。6.帕金森病小鼠模型中運動和非運動癥狀行為學(xué)改變的檢測：在DSP-4/LPS注射后12個月的時間點,從每個組(生理鹽水對照,DSP-4單獨,DSP-4+LPS,和LPS單獨)中隨機選出8只小鼠,進(jìn)行運動和非運動行為學(xué)的測試。運動行為學(xué)測定包括倒掛網(wǎng)格試驗,加速轉(zhuǎn)棒試驗,曠場試驗,以及步態(tài)障礙分析。非運動癥狀行為學(xué)的測試包括嗅覺功能測試,高架十字迷宮焦慮測試,一小時糞便收集便秘測試,驚厥反應(yīng)測試,以及Morris水迷宮學(xué)習(xí)記憶功能測試。7.神經(jīng)-膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)體系建立：培養(yǎng)體系的建立,簡言之,無菌操作下取出胎齡13/14天的Fischer 344大鼠或12/13天C57BL/6J和NADPH氧化酶基因敲除(CYBB)小鼠的胚胎,在解剖顯微鏡下分離出腹側(cè)中腦,然后輕柔地機械吹打,以破碎組織。4℃離心以除去組織細(xì)胞碎片,棄上清液,加入細(xì)胞培養(yǎng)液,計數(shù)重懸后的細(xì)胞并接種到多聚賴氨酸(20mg/ml)預(yù)包被的24孔培養(yǎng)板(5×I05/0.5m1培養(yǎng)液/孔)或96孔培養(yǎng)板(1×105/0.2m1培養(yǎng)液/孔)中。細(xì)胞培養(yǎng)在含5%二氧化碳和95%空氣的飽和濕度的37℃恒溫培養(yǎng)箱中。細(xì)胞培養(yǎng)7天用于處理時,免疫化學(xué)染色定量分析顯示神經(jīng)-膠質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)體系的細(xì)胞組成應(yīng)為：10%為小膠質(zhì)細(xì)胞,50%為星形膠質(zhì)細(xì)胞,40%為神經(jīng)細(xì)胞,在總神經(jīng)細(xì)胞中,2.5-3.5%為多巴胺(dopamine, DA)能神經(jīng)元。8.細(xì)胞系：本研究中使用到轉(zhuǎn)染NADPH氧化酶(NADPH oxidase, NOX2)的猴腎COS7-PHOX和COS7細(xì)胞系。大鼠小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系HAPI也在本研究中應(yīng)用。9.多巴胺能神經(jīng)元功能檢測：[3H]多巴胺攝取測定法用于原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)體系中多巴胺能神經(jīng)元的功能評價。簡言之,將細(xì)胞置于含濃度為1μM[3H]多巴胺的Krebs-Ringer緩沖液中37℃溫育21分鐘。之后將細(xì)胞用冰冷的Krebs-Ringer緩沖洗三次,然后收集在1NNaOH中。放射性濃度通過液體閃爍計數(shù)定量。10.炎癥因子的測定：一氧化氮(NO)含量通過測定上清液與Griess試劑反應(yīng)產(chǎn)生亞硝酸鹽的累積水平?jīng)Q定。細(xì)胞上清液中腫瘤壞死因子α (TNF-α)的測定經(jīng)TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒測定。細(xì)胞外超氧化物的測量是采用SOD抑制WST-1還原的原理與方法,簡言之,用溫的漢克氏平衡鹽溶液(HBSS)清洗培養(yǎng)板中的純小膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)-膠質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)體系2次后,每孔加入50 ul溶解在HBSS中的不同處理的藥物,37℃孵育30分鐘,再分別加入50μl溶解在HBSS中的刺激物(如LPS),最后加入100μl溶解在HBSS中的160mM WST-1(含或不含SOD,250 U/每孔)。在分光光度儀上(450nm)讀取光密度值。超氧化物的產(chǎn)量是30分鐘時吸收度的增加值,其結(jié)果表示為對照組的百分比。11.胞膜胞漿分離和Western blot分析：小膠質(zhì)細(xì)胞在低滲裂解緩沖液裂解,然后進(jìn)行勻漿。將裂解物在1600×g轉(zhuǎn)速下離心15分鐘,上清液在100000×g離心30分鐘。在1%的Nonidet P-40的低滲溶胞緩沖液中重懸,將細(xì)胞膜成分和胞漿成分分離,并進(jìn)行Western blot分析。12.血液分析：氯氮平或氯氮平-N-氧化物的第一次注射后21天,對小鼠進(jìn)行安樂死,眼球血液收集在1.5ml肝素管。充分混勻后,不同類型的血細(xì)胞的數(shù)量經(jīng)由自動血細(xì)胞計數(shù)器進(jìn)行計數(shù)。13.統(tǒng)計分析：所有的組數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。統(tǒng)計分析使用單向或雙向ANOVA把給藥作為獨立變量進(jìn)行比較。當(dāng)ANOVA呈顯著差異時,使用Dunnettpost hoc檢驗組間差異。統(tǒng)計分析使用GraphPad Prism版本6.00,設(shè)定雙面α 0.05進(jìn)行統(tǒng)計分析。研究結(jié)果1.LPS注射引起小鼠自腦干至皮質(zhì),自下而上發(fā)生有序的、漸進(jìn)性的神經(jīng)元變性死亡。1.1在LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)炎性帕金森病小鼠模型中,藍(lán)斑核去甲腎上腺素能神經(jīng)元減少早于黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元減少3-4個月。單次腹腔注射LPS在C57BL/6小鼠后,藍(lán)斑核去甲腎上腺素能神經(jīng)元最先發(fā)生減少,4個月注射LPS后LC-NE神經(jīng)元損失達(dá)30%,神經(jīng)元減少持續(xù)進(jìn)行,10個月可達(dá)52%。隨后,中腦黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元在第7個月時發(fā)生明顯減少,10個月時減少32%。同樣的結(jié)果在人類A53T轉(zhuǎn)基因小鼠中得以證實。A53T轉(zhuǎn)基因小鼠在LPS腹腔注射1個月即發(fā)生藍(lán)斑核神經(jīng)元損失,而多巴胺神經(jīng)元損失發(fā)生在3個月以后。這符合帕金森病人實際中發(fā)生的,循序漸進(jìn)性神經(jīng)元的變性死亡規(guī)律。1.2由LPS注射引起小鼠處腦干至皮質(zhì),自下而上發(fā)生的有序的、漸進(jìn)性的神經(jīng)元變性死亡。單次腹腔注射LPS在C57BL/6小鼠后,繼藍(lán)斑核去甲腎上腺素能神經(jīng)元最先發(fā)生減少和中腦黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元減少之后,10個月時,中腦以上的海馬、皮質(zhì)區(qū)也相繼發(fā)生神經(jīng)元的變性死亡。總之,我們研究結(jié)果證明,炎癥介導(dǎo)的小鼠帕金森病模型可以模擬帕金森病人表現(xiàn)出的自下而上,從腦干到皮質(zhì)的神經(jīng)元漸進(jìn)性退行性變的病理改變過程。1.3藍(lán)斑核去甲腎上腺素缺失增強LPS炎性反應(yīng)引起的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元減少。在C57BL/6小鼠單次腹腔注射LPS 6個月之后,腹腔注射4次DSP-4(50mg/k),時間間隔為每兩周一次。DSP-4誘導(dǎo)藍(lán)斑核去甲腎上腺素缺失,促使LPS炎性反應(yīng)引起的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元減少增至50%,與LPS單獨組的30%相比增加了20%。2.藍(lán)斑核-去甲腎上腺素耗竭促進(jìn)腎上腺素能神經(jīng)元投射區(qū)神經(jīng)元的退行性變和死亡。2.1藍(lán)斑核-去甲腎上腺素耗竭引起投射區(qū)發(fā)生自下而上有序、漸進(jìn)性神經(jīng)元退行性變。藍(lán)斑核-去甲腎上腺素由DSP-4注射耗盡后,首先在黑質(zhì)致密部發(fā)現(xiàn)了延遲性和進(jìn)展性的多巴胺能神經(jīng)元減少,4個月時減少32.4%,這種減少持續(xù)發(fā)展,到第10個月時減少49.9%。另外,通過DSP-4誘導(dǎo)的神經(jīng)變性隨后也延伸到皮質(zhì)和海馬。NeuN免疫組織化學(xué)染色顯示,在DSP-4給予第10個月時,海馬和皮質(zhì)的神經(jīng)元減少分別達(dá)到30.0%和27.7%。值得注意的是,對于沒有去甲腎上腺素能神經(jīng)元投射的尾殼核進(jìn)行免疫染色觀察神經(jīng)元是否受到影響,發(fā)現(xiàn)整個過程直至第10個月時,該區(qū)域的神經(jīng)元穩(wěn)定存在,未受DSP-4耗竭去甲腎上腺素的影響。2.2由DSP-4注射引起的去甲腎上腺素耗竭促使藍(lán)斑核去甲腎上腺素能神經(jīng)元投射區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生持續(xù)活化。為了探索去甲腎上腺素耗竭引起投射區(qū)神經(jīng)元變性死亡的原因,我們分別使用Iba-1和CD11b兩個小膠質(zhì)細(xì)胞胞漿和胞膜的特異性標(biāo)志物抗體檢測去甲腎上腺素能神經(jīng)元投射區(qū)(包括黑質(zhì)、海馬、皮質(zhì))小膠質(zhì)細(xì)胞的激活情況。結(jié)果顯示,在所有這些去甲腎上腺素能神經(jīng)支配的大腦區(qū)域,在DSP-4給予后的第7天時,小膠質(zhì)細(xì)胞即表現(xiàn)出明顯活化特征,包括阿米巴樣肥大形態(tài)和Iba1、CDllb染色加深、表達(dá)升高,并且小膠質(zhì)細(xì)胞的這些激活狀態(tài)一直持續(xù)至第10個月。DSP-4處理導(dǎo)致的黑質(zhì)、海馬(DG區(qū))、皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活,表現(xiàn)為CD11b染色密度的升高,以密度定量,與對照相比,第7天時,可增高至153.5%至193.8%,10個月時,升高至-250%。與此不同,對于沒有去甲腎上腺素能神經(jīng)元投射的尾殼核進(jìn)行免疫染色觀察小膠質(zhì)細(xì)胞是否受到影響,發(fā)現(xiàn)整個過程直至第10個月時,該區(qū)域的小膠質(zhì)細(xì)胞并無激活改變,未受DSP-4耗竭去甲腎上腺素的影響。2.3 dbh基因敲除誘導(dǎo)藍(lán)斑核去甲腎上腺素能神經(jīng)元投射的大腦區(qū)域神經(jīng)元變性和小膠質(zhì)細(xì)胞激活。為了進(jìn)一步驗證NE缺乏可引起神經(jīng)功能障礙和神經(jīng)炎癥反應(yīng),我們在dbh基因敲除的小鼠中檢測神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞的改變。dbh是去甲腎上腺素合成的關(guān)鍵酶,dbh基因敲除將完全阻滯NE的合成。結(jié)果跟DSP-4耗竭NE引起神經(jīng)退行性變相似,與野生型相比,dbh基因敲除產(chǎn)生的NE枯竭同樣引起藍(lán)斑核投射區(qū)(黑質(zhì)、海馬、皮質(zhì))神經(jīng)元的減少和小膠質(zhì)的持續(xù)激活,并且神經(jīng)元減少和小膠質(zhì)細(xì)胞激活在未有LC-NE投射的尾殼核區(qū)并不發(fā)生。3.去甲腎上腺素耗竭促進(jìn)LPS炎性介導(dǎo)的帕金森病小鼠模型同時出現(xiàn)運動和非運動行為學(xué)改變。3.1提前注射DSP-4促使去甲腎上腺素耗竭導(dǎo)致LPS炎性帕金森病模型中,黑質(zhì)、海馬和皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元變性和死亡增多。提前一周給予DSP-4注射以耗竭藍(lán)斑核去加腎上腺素的合成,再給予LPS引起帕金森病炎性模型,可發(fā)現(xiàn),在注射12月以后,與單獨給予LPS的組別相比,DSP-4和LPS雙重打擊可增加藍(lán)斑核投射區(qū)神經(jīng)元的變性死亡(包括黑質(zhì)、海馬、皮質(zhì)區(qū))。3.2去甲腎上腺素提前耗竭促使LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)炎性帕金森病模型中出現(xiàn)多種符合帕金森病人中運動癥狀出現(xiàn)之前的多種非運動癥狀。與鹽水對照或LPS單獨給予組相比,DSP-4和LPS雙重打擊可以誘導(dǎo)小鼠帕金森病炎性模型中出現(xiàn)多種類似帕金森病人運動前癥狀的行為學(xué)改變,包括埋藏食物探索實驗得出的嗅覺減退,梯形十字架迷宮實驗得出的焦慮抑郁癥狀,一小時糞便試驗中表現(xiàn)出的便秘胃腸功能紊亂等。3.3去甲腎上腺素提前耗竭促使LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)炎性帕金森病模型中出現(xiàn)多種帕金森病相關(guān)運動行為學(xué)改變。與生理鹽水對照組相比,DSP-4或/和LPS注射小鼠在倒掛網(wǎng)格試驗、加速轉(zhuǎn)棒實驗中表現(xiàn)出潛伏期明顯縮短,曠場試驗中邊緣移動時間和距離明顯減少。在自主行動步態(tài)檢測中,DSP-4和LPS雙重打擊小鼠出現(xiàn)步態(tài)紊亂癥狀,表現(xiàn)為步幅縮短、后肢間距拉大,步態(tài)角度變寬、足外翻、拖步行動、自由活動受限等。3.4去甲腎上腺素提前耗竭促使LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)炎性帕金森病模型中出現(xiàn)小鼠驚恐反應(yīng)。在DSP-4和LPS注射12個月之后,與生理鹽水對照組相比較,小鼠表現(xiàn)出明顯前脈沖抑制和驚恐反應(yīng)增強。而在LPS或DSP-4單獨暴露組,并無此反應(yīng)。結(jié)果表明,DSP-4和LPS合并暴露促進(jìn)帕金森病人中易出現(xiàn)的驚恐反應(yīng)的發(fā)生。3.5去甲腎上腺素提前耗竭促使LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)炎性帕金森病模型中小鼠認(rèn)知能力下降。在DSP-4和LPS注射12月之后,行Morris水迷宮實驗發(fā)現(xiàn),與生理鹽水對照組相比較,DSP-4,LPS或DSP-4+LPS處理小鼠出現(xiàn)認(rèn)知障礙以及學(xué)習(xí)記憶能力下降。4.突觸外旁分泌的低濃度去甲腎上腺素通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞免疫活性發(fā)揮抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用。4.1在原代培養(yǎng)的神經(jīng)膠質(zhì)混合培養(yǎng)體系中,亞微摩爾濃度水平去甲腎上腺素保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元免受LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性損傷。[3H]多巴胺攝取試驗表明,去甲腎上腺素預(yù)處理可以重塑多巴胺能神經(jīng)元的功能,并在10-6-10-9濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量反應(yīng)關(guān)系。多巴胺能神經(jīng)元經(jīng)THIR抗體免疫組織化學(xué)染色細(xì)胞計數(shù)的結(jié)果進(jìn)一步證明,去甲腎上腺素預(yù)處理可以逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元毒性損傷和數(shù)量減少,在10-6-10-9濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量反應(yīng)關(guān)系。除了恢復(fù)多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)量,NE減少了炎癥介導(dǎo)的神經(jīng)毒性相關(guān)的多巴胺能神經(jīng)突起退縮和退化。兩者合計表明,去甲腎上腺素對LPS誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)毒性具有保護(hù)作用。4.2小膠質(zhì)細(xì)胞在低濃度去甲腎上腺素保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元免受炎性損傷中必不可少。在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的混合培養(yǎng)體系中,NE(10-7M)有效逆轉(zhuǎn)MPP+誘導(dǎo)的[3H]DA攝取減少,可恢復(fù)20%,但當(dāng)去除該體系中的小膠質(zhì)細(xì)胞時,這一保護(hù)作用消失。這表明,去甲腎上腺素介導(dǎo)的多巴胺神經(jīng)保護(hù)需要小膠質(zhì)細(xì)胞的存在,提示去甲腎上腺素可能是通過抑制小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活而發(fā)揮作用。4.3低濃度去甲腎上腺素可以降低LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化,并減少促炎因子的釋放。經(jīng)Iba-1抗體對小膠質(zhì)細(xì)胞的特異性免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果表明,LPS暴露后24小時,與對照組相比,小膠質(zhì)細(xì)胞明顯激活,表現(xiàn)為胞體肥大、分枝和凸起增多,Iba-1表達(dá)升高,但是去甲腎上腺素預(yù)處理組小膠質(zhì)細(xì)胞的激活明顯受到抑制(與LPS組相比),小膠質(zhì)細(xì)胞多處于胞體小、凸起少的靜息狀態(tài)。Iba-1染色的細(xì)胞計數(shù)結(jié)果也進(jìn)一步證實激活狀態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞明顯少于LPS組。除了形態(tài)學(xué)觀察,去甲腎上腺素預(yù)處理抑制了活化的小膠質(zhì)細(xì)胞促炎因子的釋放,表現(xiàn)為與LPS相比,TNF-α,一氧化氮和超氧化物的產(chǎn)生均明顯降低和減少,并在10-6-10-9濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量反應(yīng)關(guān)系。4.4β2去甲腎上腺素能受體部分參與介導(dǎo)低濃度去甲腎上腺素的抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用。與野生型(wild type,WT)相比,p2去甲腎上腺素能受體基因敲除(β 2-AR-/-)可以部分逆轉(zhuǎn)去甲腎上腺素對LPS誘導(dǎo)的TNF-α釋放的抑制作用,但不能完全逆轉(zhuǎn),這提示可能另有其他信號通路同時參與介導(dǎo)了去甲腎上腺素的抗炎作用。與此同時,中腦神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)體系中,[3H]多巴胺攝取量的測定也證實,去甲腎上腺素的神經(jīng)保護(hù)作用僅部分受β2去甲腎上腺素能受體基因敲除的抑制。LPS引起[3H]多巴胺攝取量在WT和β2-AR-/-中都降低為50%,但在WT中,去甲腎上腺素預(yù)處理可以逆轉(zhuǎn)至80%,而β2-AR-/-中只有65%。4.5低濃度去甲腎上腺素依賴于NOX2抑制LPS誘導(dǎo)的超氧化物的產(chǎn)生,并不受p2去甲腎上腺素能受體影響。在LPS處理的混合膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)體系中,(+)-NE和(-)-NE兩種形式的去甲腎上腺素可同等程度抑制LPS誘導(dǎo)的超氧化物的產(chǎn)生。因為(+)-NE與受體的親和力遠(yuǎn)低于(-)-NE,這提示去甲腎上腺素抑制超氧化物的產(chǎn)生并不通過作用于受體的途徑。在COS7-PHOX細(xì)胞系中,這一結(jié)果被進(jìn)一步證實,(+)-NE和(-)-NE兩個異構(gòu)體可以同等程度抑制佛波脂(phorbol myristate acetate,PMA)誘導(dǎo)COS7-PHOX細(xì)胞系產(chǎn)生超氧化物。此外,在WT和β2-AR-/-的混合膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)體系中,(+)-NE和(-)-NE兩個異構(gòu)體去甲腎上腺素對LPS引起的超氧化物的抑制作用相當(dāng)。提前將去甲腎上腺素其他非特異性G蛋白偶聯(lián)受體α1或β1受體分別經(jīng)酚妥拉明和普萘洛爾阻斷,對NE抑制LPS誘導(dǎo)超氧化物產(chǎn)生也無影響。綜合表明腎上腺素的所有特異性和非特異性的G蛋白偶聯(lián)受體,均沒有參與調(diào)解NE抑制超氧化物產(chǎn)生的作用。4.6低濃度去甲腎上腺素抑制LPS誘導(dǎo)p47phox蛋白由胞漿到胞膜的轉(zhuǎn)運。HAPI小膠質(zhì)細(xì)胞系的Western blot分析結(jié)果表明,LPS處理可以顯著降低p47phox蛋白在胞漿的含量,同時其在胞膜的含量增加,但是去甲腎上腺素預(yù)處理可以有效的抑制p47phox蛋白這種由胞漿到胞膜的轉(zhuǎn)運,p47phox胞漿到胞膜轉(zhuǎn)運是NOX2活化的必須反應(yīng)步驟,這一結(jié)果提示去甲腎上腺素可以抑制NOX2的活化,從而抑制超氧化物的產(chǎn)生。4.7 NOX2介導(dǎo)低濃度去甲腎上腺素獨立于β2腎上腺素受體的抗炎/神經(jīng)保護(hù)作用。為了確定NOX2是否為除β2腎上腺素受體之外,介導(dǎo)低濃度去甲腎上腺素抗炎/神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)的作用靶點,我們將NE對NOX2的抑制作用與NOX2的特異性抑制劑DPI相對比,發(fā)現(xiàn)NE與DPI相同程度抑制TNF-α產(chǎn)生和提升[3H]多巴胺攝取能力的作用,而且兩者同時存在時沒有疊加效應(yīng)而是相互競爭。除此之外,在NOX2基因敲除的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)體系中同時經(jīng)ICI-118,551完全阻斷去甲腎上腺素能受體的作用時,去甲腎上腺素的抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用就完全被阻滯。這些數(shù)據(jù)表明,NOX2是除β2腎上腺素受體之外,介導(dǎo)低濃度去甲腎上腺素抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用的另一唯一靶點。4.8 NOX2特異性抑制劑(DPI)干預(yù)可以減少小鼠大腦中由于去甲腎上腺素耗竭引起的小膠質(zhì)細(xì)胞活化。C57BL/6小鼠在給予DSP-4阻滯藍(lán)斑核分泌去甲腎上腺素后,第4天可以明顯觀察到藍(lán)斑核去甲腎上腺素能神經(jīng)元的投射區(qū)(包括黑質(zhì)區(qū))小膠質(zhì)細(xì)胞的活化,但是NOX2特異性抑制劑DPI干預(yù)可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化,表現(xiàn)為與DSP-4組相比,小膠質(zhì)細(xì)胞的特異性CD11b抗體染色密度降低。5.氯氮平代謝產(chǎn)物(CNO和NDC)通過作用于小膠質(zhì)細(xì)胞NOX2抑制其活化保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元免受炎性損傷。5.1在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的混合培養(yǎng)體系中,氯氮平代謝產(chǎn)物(CNO和NDC)保護(hù)多巴胺神經(jīng)元免受LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性損傷。CNO或NDC預(yù)處理保護(hù)多巴胺神經(jīng)元免受LPS誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷,表現(xiàn)為對[3H]多巴胺攝取能力的重塑和降低多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量的減少,并呈現(xiàn)凸形劑量反應(yīng)關(guān)系。CNO和NDC最有效的濃度分別為0.01μm和0.1μm。5.2小膠質(zhì)細(xì)胞在CNO和NDC的神經(jīng)保護(hù)作用中至關(guān)重要。在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的完全混合培養(yǎng)體系中,CNO和NDC都對神經(jīng)炎性誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元損傷具有明顯的保護(hù)作用,但當(dāng)在培養(yǎng)體系中撤除小膠質(zhì)細(xì)胞時,這些保護(hù)作用也隨之消失,說明小膠質(zhì)細(xì)胞是CNO和NDC發(fā)揮有效神經(jīng)保護(hù)作用的靶點細(xì)胞。對小膠質(zhì)細(xì)胞的免疫組織化學(xué)特異性抗體Iba-1和CD11b染色和Western bot定量結(jié)果表明,CNO和NDC可以有效抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化。進(jìn)一步對TNF-α和NO等炎性因子的檢測表明,CNO和NDC可以有效抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化產(chǎn)生的炎性因子的釋放。5.3 CNO和NDC的抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用的關(guān)鍵靶點是小膠質(zhì)的NOX2。來源于NOX2基因敲除的小鼠的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)體系中,CNO和NDC的抑制炎癥因子產(chǎn)生和重塑神經(jīng)元[3H]多巴胺攝取能力的作用均被阻滯。在HAPI小膠質(zhì)細(xì)胞系的Western blot分析中,CNO和NDC可以有效抑制LPS誘導(dǎo)的p47phox蛋白從胞漿到胞膜的轉(zhuǎn)運。綜合結(jié)果表明,CNO和NDC可以通過作用于NOX2抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。5.4 CNO減弱MPTP誘發(fā)的多巴胺能神經(jīng)元的損傷和運動障礙,且不顯示中性粒細(xì)胞毒性。MPTP注射誘導(dǎo)的小鼠帕金森病模型中,在第14天時,小鼠出現(xiàn)明顯的運動障礙,表現(xiàn)為加速轉(zhuǎn)棒實驗潛伏期的縮短43%。同時實驗結(jié)束,第21天時對多巴胺神元的染色和計數(shù)結(jié)果表明,多巴胺神經(jīng)元大約減少50%。但是CNO與氯氮平治療可以明顯改善小鼠的運動障礙和多巴胺能神將元的減少,表現(xiàn)為使轉(zhuǎn)棒潛伏期恢復(fù)到85%,多巴胺能神經(jīng)元的減少降到28%。氯氮平的臨床應(yīng)用因為其中性粒細(xì)胞毒性而受到限制,因此在體實驗中,我們同時檢測氯氮平和CNO是否引起中性粒細(xì)胞減少,結(jié)果顯示與母體化合物氯氮平相比,CNO長達(dá)連續(xù)21天的治療對嗜中性粒細(xì)胞無任何毒性,表現(xiàn)為全血樣品中白細(xì)胞的數(shù)量沒有改變。5.5 CNO抑制MPTP誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性激活。在MPTP處理的小鼠,小膠質(zhì)發(fā)生活化,特征表現(xiàn)為胞體肥大、分枝增多,黑質(zhì)區(qū)CDllb染色密度增加。與MPTP單獨組相比,氯氮平和CNO治療可以顯著抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化,降低CD11b染色的密度。結(jié)論1.在炎性介導(dǎo)的小鼠帕金森病模型中,藍(lán)斑核的去甲腎上腺素能神經(jīng)元減少相比黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的減少要早3-4個月。2.藍(lán)斑核去甲腎上腺素耗竭引起大腦中腎上腺素能神經(jīng)元投射區(qū)神經(jīng)元發(fā)生自下而上有序的、漸進(jìn)性、慢性進(jìn)行性神經(jīng)退行性變。3.較早發(fā)生的藍(lán)斑核去甲腎上腺素耗竭促使炎性介導(dǎo)的帕金森病小鼠模型中出現(xiàn)帕金森病人中的多種運動和非運動癥狀的神經(jīng)行為學(xué)改變。4.突觸外旁分泌的去甲腎上腺素通過作用于小膠質(zhì)細(xì)胞起到神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)作用。5.突觸外旁分泌的去甲腎上腺素發(fā)揮抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用時,除傳統(tǒng)的G蛋白偶聯(lián)受體β2-AR外,發(fā)現(xiàn)有一個全新的作用靶點,即小膠質(zhì)細(xì)胞的NOX2。6.通過作用于小膠質(zhì)細(xì)胞NOX2抑制其激活,氯氮平代謝產(chǎn)物CNO和NDC可以有效保護(hù)多巴胺神經(jīng)元免受炎癥毒性損傷。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R742.5
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本文編號：1465663