本文關(guān)鍵詞：綿羊低豐度FecB基因檢測(cè)方法的建立和BMPR-1B基因打靶的研究　出處：《石河子大學(xué)》2017年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：綿羊的產(chǎn)羔率是其主要經(jīng)濟(jì)性狀之一,直接關(guān)系到養(yǎng)羊業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。產(chǎn)羔率受多個(gè)主效基因的控制,其中骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體lB(BMPR-1B)發(fā)生A746G突變后被稱(chēng)作FecB基因,其增羔效應(yīng)最顯著,而且遺傳穩(wěn)定,有加性效應(yīng),一直受到人們的關(guān)注。FecB基因主要分布在一些高產(chǎn)的多胎品種中,但有些低產(chǎn)綿羊品種中也有攜帶FecB基因的少數(shù)個(gè)體,而且其產(chǎn)羔率顯著地高于其它羊只。如果能夠篩選出這些特殊的個(gè)體,加以精心擴(kuò)繁培育,對(duì)于本品種選育改良以及培育高產(chǎn)的新品系無(wú)疑具有非常重要的意義,而目前所報(bào)道的綿羊FecB基因檢測(cè)方法,如果用于大群篩查檢測(cè),則費(fèi)時(shí)費(fèi)工。另外,綿羊FecB基因因其優(yōu)良的增羔效應(yīng)已得到廣泛的利用,主要方式是通過(guò)引入雜交以改良當(dāng)?shù)氐彤a(chǎn)品種,但當(dāng)?shù)氐彤a(chǎn)羊固有的一些優(yōu)良性能隨之受到影響。如果通過(guò)基因組編輯技術(shù)定點(diǎn)突變綿羊的BMPR-1B基因,產(chǎn)生FecB基因,可以在不引入外血的情況下,提高綿羊的繁殖性能,針對(duì)性地提高產(chǎn)羔率,但目前這方面的研究很少。[研究目的]:本研究的目的就是建立一種綿羊FecB基因低豐度檢測(cè)方法,為其大群高通量快速篩查檢測(cè)提供便利;并通過(guò)基因打靶在阿勒泰羊中引入FecB基因,以提高其產(chǎn)羔率,同時(shí)為其它低產(chǎn)綿羊提供借鑒意義。[研究方法]:1.綿羊低豐度FecB基因檢測(cè)方法的建立首先,我們按照低變性溫度共擴(kuò)增PCR(Co-amplification at lower denaturation temperature-PCR,COLD-PCR)和高分辨率溶解曲線(xiàn)分析(High resolution curve analysis,HRM)的實(shí)驗(yàn)要求,設(shè)計(jì)合成綿羊FecB基因檢測(cè)引物。提取湖羊和阿勒泰羊的基因組,經(jīng)FecB基因的測(cè)序檢測(cè)后,制備了COLD-PCR的模板標(biāo)準(zhǔn)品。然后,用模板標(biāo)準(zhǔn)品建立了FecB基因的qPCR HRM分型方法,檢測(cè)了其分型靈敏度;并應(yīng)用于320只湖羊的FecB分型實(shí)驗(yàn),測(cè)序檢測(cè)其分型準(zhǔn)確性,統(tǒng)計(jì)產(chǎn)羔率,進(jìn)行了FecB基因型和產(chǎn)羔率關(guān)聯(lián)分析。最后,經(jīng)過(guò)優(yōu)化條件,建立低豐度FecB基因的COLD-PCR HRM檢測(cè)方法,并對(duì)方法的可重復(fù)性做了驗(yàn)證。2.阿勒泰羊胎兒成纖維細(xì)胞BMPR-1B基因A746G突變(以下稱(chēng)之為“FecB突變”)陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株的制備本研究設(shè)計(jì)并委托公司構(gòu)建了一對(duì)TALENs質(zhì)粒,通過(guò)測(cè)序和HRM檢測(cè)其作用活性。設(shè)計(jì)構(gòu)建了綿羊BMPR-1B基因打靶載體PMD18-L-loxp-pA-noe-PGK-loxp-RPGK-DTA-pA(命名為K1)和負(fù)篩選打靶載體PMD18-L-loxp-pA-R-PGK-DTA-pA(命名為K2),測(cè)序驗(yàn)證序列正確性,設(shè)計(jì)合成單鏈脫氧寡核苷酸(Single stranded oligodeoxynucleotides,SSO),三者分別作為同源重組的DNA模板。分離培養(yǎng)了阿勒泰羊胎兒成纖維細(xì)胞,HRM和測(cè)序檢測(cè)其FecB攜帶情況,并做了性別檢測(cè)。分別用三個(gè)同源重組的dna模板與talens質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染阿勒泰羊胎兒成纖維細(xì)胞;同時(shí)用熒光報(bào)告載體pegfp-n1代替同源重組的dna模板,做為對(duì)照平行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48小時(shí)后,在熒光倒置顯微鏡高倍視野下肉眼計(jì)數(shù)細(xì)胞,通過(guò)分別在白光和紫外光下統(tǒng)計(jì)相同視野的細(xì)胞總數(shù)計(jì)算細(xì)胞的熒光率,或者通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光率以評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。sso和k2打靶載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞傳一代,待細(xì)胞活力恢復(fù)后,通過(guò)有限稀釋法制備單克隆細(xì)胞株;k1打靶載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞傳一代后,通過(guò)g418篩選,制備抗性單克隆,選取活力較好的抗性單克隆進(jìn)行第二輪g418篩選,得到單克隆細(xì)胞株。單克隆細(xì)胞株通過(guò)測(cè)序和檢測(cè)兩同源臂間序列的敲入情況進(jìn)行突變陽(yáng)性檢測(cè)。3.阿勒泰羊fecb突變胚胎和個(gè)體的構(gòu)建采集綿羊卵母細(xì)胞,經(jīng)過(guò)檢測(cè)為fecb突變陽(yáng)性的單細(xì)胞克隆株用作供體,進(jìn)行核移植,經(jīng)過(guò)電融合、激活和短暫培養(yǎng)后,得到的重構(gòu)胚胎,部分移植到發(fā)情的代孕母羊;另一部分繼續(xù)培養(yǎng)一周,觀(guān)察胚胎發(fā)育情況,統(tǒng)計(jì)囊胚率。同時(shí),以未打靶細(xì)胞作為核移植供體,進(jìn)行同樣的操作,重構(gòu)胚培養(yǎng)1周,作為實(shí)驗(yàn)組胚胎發(fā)育的對(duì)照,檢測(cè)基因打靶對(duì)囊胚發(fā)育的影響。另外,我們嘗試了綿羊受精卵顯微注射法,同時(shí)注射talens質(zhì)粒和k2打靶載體,當(dāng)天胚胎移植,期望得到基因打靶陽(yáng)性羔羊。[研究結(jié)果]:1.綿羊fecb基因的cold-pcrhrm檢測(cè)本研究建立的綿羊fecb基因qpcrhrm分型方法,曲線(xiàn)分離清晰良好,檢測(cè)下限為2%,用于320只湖羊的fecb基因分型,結(jié)果清晰準(zhǔn)確。關(guān)聯(lián)分析顯示,湖羊bb型比b+型多產(chǎn)羔1.56只,支持fecb基因?yàn)楹蚨嗵ブ餍Щ虻挠^(guān)點(diǎn)。本研究建立的綿羊fecb基因cold-pcrhrm檢測(cè)方法,將qpcrhrm的檢測(cè)下限降到0.5%,檢測(cè)重復(fù)性好。2.fecb突變陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株的制備結(jié)果經(jīng)檢測(cè),talens質(zhì)粒具有一定的作用活性,可以用于下游實(shí)驗(yàn)。打靶載體經(jīng)測(cè)序檢測(cè),序列正確無(wú)誤。細(xì)胞電轉(zhuǎn)染和核轉(zhuǎn)染的最高轉(zhuǎn)染效率分別為70.6%和90%左右。共轉(zhuǎn)染soo和共轉(zhuǎn)染k2打靶載體的細(xì)胞,通過(guò)有限稀釋法分別獲得162個(gè)和99個(gè)單克隆細(xì)胞株,單細(xì)胞形成克隆效率分別為25.0%和30.1%,經(jīng)過(guò)測(cè)序檢測(cè),均無(wú)fecb突變陽(yáng)性的細(xì)胞株。共轉(zhuǎn)染k1打靶載體的細(xì)胞經(jīng)過(guò)兩輪418篩選,共獲得5個(gè)單克隆細(xì)胞株,其pcr產(chǎn)物測(cè)序,據(jù)峰圖判斷,沒(méi)有突變純合子,但有2個(gè)雜合子。初步鑒定的雜合子經(jīng)pcr產(chǎn)物ta克隆再次測(cè)序,二者確定為雜合子。這2個(gè)細(xì)胞株形態(tài)正常,具有一定的活力,可以作為核移植供體,為阿勒泰羊fecb突變胚胎和個(gè)體的構(gòu)建奠定了細(xì)胞基礎(chǔ)。3.阿勒泰羊fecb突變胚胎和個(gè)體構(gòu)建的結(jié)果在胚胎構(gòu)建和發(fā)育實(shí)驗(yàn)中,我們以fecb突變陽(yáng)性細(xì)胞為供體,通過(guò)核移植,共獲得重構(gòu)胚胎89個(gè),卵裂率為69.9%,囊胚率為14.9%,和未經(jīng)打靶處理的對(duì)照組相比,差別不顯著。在胚胎移植實(shí)驗(yàn)中,我們共移植了14只代孕母羊,經(jīng)過(guò)b超檢查有2只疑為受孕,但最終沒(méi)發(fā)現(xiàn)有流產(chǎn)或產(chǎn)羔情況。另外,TALENs表達(dá)質(zhì)粒和K2打靶載體顯微注射了合格的受精卵共計(jì)44個(gè),胚胎移植了22只母羊。妊娠60 d后B超檢查,妊娠率63.6%。流產(chǎn)1只,產(chǎn)羔13只,產(chǎn)羔率59%。經(jīng)測(cè)序檢測(cè),流產(chǎn)胎兒和羔羊均為FecB陰性。[結(jié)論]本研究建立的低豐度FecB基因COLD-PCR HRM檢測(cè)方法,適用于綿羊FecB基因的大群快速篩查工作,具有重復(fù)可靠性。本研究通過(guò)基因打靶,最終沒(méi)有得到BMPR-1B基因FecB突變的阿勒泰羊個(gè)體,但獲得了FecB突變雜合子單克隆細(xì)胞株和發(fā)育正常的重構(gòu)胚胎,為FecB突變阿勒泰羊的重新構(gòu)建以及FecB基因作用機(jī)理的研究提供了材料。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S826

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本文編號(hào)：1377630