目的:隨著人口老齡化的逐漸加劇,骨質疏松的發(fā)病率將逐年上升,預計到2050年中國的骨質疏松患者將達到2.12億人。由骨質疏松引發(fā)的慢性疼痛、骨折及活動受限給患者及社會帶來了巨大的負擔。如何預防骨質疏松的發(fā)生及有效治療骨質疏松發(fā)生后的并發(fā)癥是各個領域學者亟待解決的問題�？棺枇\動是刺激骨代謝的一種主要運動方式,抗阻力運動可以增加對骨的應力刺激,改善骨代謝水平,刺激骨形成。目前,許多學者的研究結果表明,抗阻力運動對骨組織及骨質疏松的防治有積極作用,但鮮有人研究長期規(guī)律的抗阻力運動對骨質疏松后骨損傷的愈合是否有促進作用。關于抗阻力運動對防治骨質疏松的作用機制亦不明確。低強度脈沖超聲(LIPUS)是一種物理刺激,在臨床應用中具有無創(chuàng)傷、非侵入性、操作方便、無副作用的優(yōu)點。在臨床治療骨折和骨延遲愈合中,LIPUS已被廣泛應用。但LIPUS在骨質疏松防治中的作用仍然存在爭議。LIPUS對骨作用的機制尚不完全明確。肌肉和骨骼在解剖結構及生理代謝方面有著緊密聯(lián)系,最近研究表明,肌肉分泌的負向調控因子肌肉生長抑制素(MSTN)對骨骼有著重要影響,MSTN缺失會對骨骼產生積極作用。因此,本實驗通過去卵巢構建骨質疏松大鼠模型,去卵巢后對大鼠進行負重爬梯運動干預,干預結束后大鼠右側股骨鉆取1.0 mm雙側穿透的孔,構建骨損傷模型,并給予LIPUS干預。從MSTN基因入手,探討負重爬梯運動和LIPUS干預對骨質疏松及骨損傷的影響及其分子機制。以期為預防骨質疏松及治療骨損傷提供理論層面的依據(jù)。方法:3月齡健康雌性SD大鼠85只,隨機分為:假手術組(Sham Operation,Sham)和去卵巢組(Ovariectomized,OVX)。OVX組進行雙側卵巢切除手術,Sham組保留卵巢只切除卵巢旁同等大小的脂肪。去卵巢2w后待大鼠傷口恢復,將OVX大鼠隨機分為:去卵巢對照組(Ovariectomized,OVX),去卵巢負重爬梯組(Ovariectomized + Exercise,OEX),去卵巢超聲干預組(Ovariectomized +Ultrasound,OUS),去卵巢負重爬梯 LIPUS 聯(lián)合干預組(Ovariectomized + Exercise+ Ultrasound,OEU)。使用實驗室自主專利產品對OEX組和OEU組進行6 d/w,持續(xù)10 w的遞增負荷負重爬梯運動干預,爬梯高1m,傾斜角度為85°,每級階梯間隔2 cm。Sham組、OVX組和OUS組不予運動干預。10 w后Sham組和OVX組各取6只大鼠,OEX組和OEU組各取3只大鼠處死,留取血清和組織以待檢測。其余大鼠,對右側股骨進行骨損傷模型構建,模型構建成功后,OUS組和OEU組進行LIPUS治療干預,每天干預20 min,每周干預6 d,持續(xù)3 w。使用雙能X射線檢測大鼠股骨骨密度,ELISA法檢測大鼠血清雌激素和MSTN表達,使用比色法檢測血清堿性磷酸酶和血清抗酒石酸性磷酸酶含量,使用Micro-CT對大鼠股骨遠端及骨損傷區(qū)域進行掃描分析,使用三點彎曲力學測試系統(tǒng)檢測大鼠股骨的力學性能,使用HE染色法對大鼠股骨干骺端進行形態(tài)學觀察,使用RT-qPCR和Weatern blot法檢測大鼠股骨遠端及股四頭肌MSTN和Wnt信號通路關鍵分子的表達,以分析探討負重爬梯運動和LIPUS作用于骨的生物學機制。結果:1.大鼠體重、抓力、骨重、股四頭肌重量和骨密度結果:與Sham組相比,OVX大鼠體重顯著增加(P0.01),抓力降低(P0.05),股四頭肌重減輕(P0.05);與OVX組相比,OEX組股四頭肌重量(P0.05)和抓力(P0.01)顯著增加。進行負重爬梯運動5 w后OEX組大鼠體重開始顯著低于OVX組(P0.05)。BMD檢測結果顯示,與Sham組相比,OVX組和OEX組BMD顯著降低(P0.01);與OVX組相比,OEX組BMD顯著增高(P0.05)。鉆孔損傷3 w后,與Sham組相比,OVX、OEX、OUS、OEU各組的抓力均顯著降低(P0.01),而OVX、OEX、OUS、OEU各組間比較并無顯著性差異。運動和LIPUS干預均顯著增加了肌肉重量(P0.01),股骨重量在各組間無顯著性變化。2.大鼠血清指標檢測結果:負重爬梯運動顯著抑制了去卵巢大鼠血清Tracp活性(P0.05),增加了血清ALP和E2含量(P0.05),但在骨損傷停止運動3 w后對ALP和E2的顯著影響消失。骨損傷后LIPUS干預,顯著降低了血清Tracp活性(P0.01),增加了 ALP活性(P0.01)。損傷前進行運動和LIPUS治療聯(lián)合干預對血清ALP和Tracp的作用效果要優(yōu)于兩者單獨干預。LIPUS單獨干預對血清E2無顯著影響。3.大鼠股骨遠端顯微結構測試結果:去卵巢后12 w,Micro-CT三維重建圖像顯示,OVX大鼠松質骨骨小梁數(shù)量明顯減少,骨小梁間隙明顯增大,分離度增加,負重爬梯運動顯著改善了去卵巢大鼠松質骨結構。定量分析結果顯示,OVX組的 BMD、BV/TV、Tb.N 與 DA(P0.01)均顯著低于 Sham 組,而 Tb.Sp(P0.01)顯著高于 Sham 組;與 OVX 組相比,OEX 組 BMD、BV/TV、Tb.N 與 DA(P0.05或0.01)均顯著提高,Tb.Sp(P0.01)顯著降低;各組間Tb.Th值無顯著性差異。骨損傷3 w后,運動對大鼠骨顯微結構的改善作用依然存在。LIPUS干預治療后,與OVX組相比,OUS和OEU組BMD、Tb.N、Tb.Th(P0.01或P0.05)均顯著增高,Tb.Sp顯著降低(P0.05),而BV/TV和DA與OVX組無顯著變化;OEX、OUS、OEU三組之間數(shù)據(jù)結果無顯著性差異。4.大鼠股骨損傷愈合結果:大鼠股骨損傷處的二維和三維重建圖顯示:OVX與Sham組相比,骨愈合明顯延遲,體現(xiàn)在鉆孔后第10天較少的新骨生成和鉆孔后第21天皮質缺損部位較低的復原率。與OVX組相比,OEX、OUS和OEU組均顯現(xiàn)出較好的骨愈合趨勢,體現(xiàn)在鉆孔后第10天較多的新骨生成,鉆孔后第21天較好的皮質缺損部位橋接。定量分析鉆孔后21 d時損傷部位的愈合度,OVX組愈合度顯著低于Sham組(P0.01),而OEX、OUS和OEU組孔愈合度均顯著高于 OVX 組(P0.01)。5.大鼠股骨生物力學測試結果:負重爬梯運動顯著改善了大鼠結構力學性能(P0.01或P0.05),對材料力學性能無顯著改善作用。鉆孔損傷后,OVX組股骨力學性能各項指標依然顯著低于Sham組,與OVX組相比,OEX組極限載荷和能量吸收顯著增高(P0.01),而剛度和彈性模量與其無顯著差異。OUS組和OEU組,各項指標均顯著增高(P0.01或P0.05),但OEX、OUS和OEU三組之間無顯著差異。6.大鼠血清和股四頭肌MSTN表達結果:負重爬梯運動顯著抑制了去卵巢大鼠血清MSTN和股四頭肌MSTN表達(P0.01),這一抑制效應在停止運動3 w后依然存在。骨損傷后,LIPUS干預顯著降低了血清MSTN含量和股四頭肌MSTN表達(P0.01)。負重爬梯運動和LIPUS聯(lián)合干預的效果要優(yōu)于LIPUS單獨作用效果(P0.05)。7.MSTN和Wnt信號通路關鍵分子表達結果:10 w負重爬梯運動顯著抑制了MSTN 下游分子 ACTRIIB、Smad2/3、P-Smad3 及 GSK-3β mRNA 水平和蛋白表達量,促進了 Wntl和β-catenin基因和蛋白表達。在骨損傷并進行3wLIPUS干預治療后,與 OVX 組相比 LIPUS 顯著抑制了 ACTRIIB、Smad2/3、P-Smad3 及 GSK-3βmRNA水平和蛋白表達量,促進了 Wnt1和β-catenin mRNA和蛋白水平表達量。兩者聯(lián)合作用對Gsk-3βmRNA和蛋白水平、Wnt1 mRNA水平的作用效果優(yōu)于單獨作用的效果。結論:1.負重爬梯運動可有效地抑制去卵巢導致的骨代謝失調、骨量丟失、骨微結構紊亂和骨生物力學性能下降,這一改善狀況在運動停止3 w后未完全消失。2.前期負重爬梯運動顯著促進了大鼠股骨損傷愈合速度,在骨損傷后施加LIPUS干預亦可顯著加速骨損傷的愈合、改善股骨顯微結構、增強股骨的力學性能。兩者聯(lián)合干預對骨代謝指標的作用效果優(yōu)于兩者單獨干預,但兩者聯(lián)合干預對股骨顯微結構、孔愈合度和生物力學性能的影響與兩者單獨干預無顯著差異。3.負重爬梯運動和LIPUS干預抑制骨量流失和改善骨微結構,加速骨愈合的潛在機制可能是通過抑制MSTN信號通路中ActrIIB、Smad2、Smad3等信號分子的表達,進而調節(jié)β-catenin、Gsk-3β等關鍵信號分子的表達,激活Wnt/β-catenin信號通路,抑制骨吸收,加速骨形成。但因本實驗未進行信號通路關鍵基因阻斷實驗研究,尚不能得出確切結論,仍需后續(xù)實驗研究支持說明。
【學位單位】：陜西師范大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R580;G804.2
【部分圖文】：

作ｌｃｍ直切口，用剪刀將皮膚和皮下筋膜剪開，在豎脊肌的邊緣剪開腹肌，用鑷??子支撐打開腹腔，看見脂肪后小心將其提出，找到粉紅色卵巢后縫扎下方血管及??脂肪、子宮，切除卵巢，逐層縫合肌肉和皮膚，用碘伏消毒傷口（如圖１所示）。對??隨機選取的２０只假手術組大鼠，保留卵巢，只將卵巢旁同等體積的脂肪切除。實??驗中有５只大鼠不能適應麻醉劑量死亡，從麻醉中清醒過來的大鼠，沒有出現(xiàn)傷??口感染全部存活。??２．２．３骨損傷模型構建??本實驗參考Ｃｈｅｎｇ等［１３３］構建模型的方法構建本實驗骨損傷模型。在大鼠去卵??巢后１２?ｗ，負重爬梯運動干預結束后進行骨損傷模型構建。模型構建中使用的所??有器械均經過高壓或酒精消毒滅菌處理。手術中的麻醉手段，選擇３％的戊巴比妥??１７??

暴露出股骨，選取好位置后，固定好股骨，用１．０ｍｍ的鉆頭進行打孔，保證??鉆頭垂直穿過股骨。用滅菌處理的生理鹽水將股骨及傷口中的骨屑沖出，用消毒??后浸潤生理鹽水的縫合針線逐層縫合切口，損傷模型構建效果如圖２所示。為了??預防手術后感染，在大鼠傷口處仔細用浸潤碘伏的棉簽涂抹。該骨損傷模型無需??任何固定措施，不影響大鼠的正�；顒樱笫笤冢欤玻浜蠼钥勺杂苫顒�。鉆孔完成??２４?ｈ后正位Ｘ線片觀察患肢，觀測骨損傷的狀況，要求無骨折現(xiàn)象發(fā)生，傷口無??感染。??二：－、餐?Ｘ、??圖１去卵巢骨質疏松模型構建過程??自??Ｕａ??圖２大鼠損傷孔Ｍｉｃｒｏ－ｃｔ重建圖示。（Ａ）大鼠右側股骨整體圖示，（Ｂ）骨鉆孔損傷處三??維圖示，（Ｃ）骨鉆孔損傷處二維圖示。??１８??

去卵巢后兩周，待大鼠傷口基本愈合后，使用實驗室自主專利產品對ＯＥＸ組和??ＯＥＵ組進行６ｄ／ｗ的尾部負重爬梯運動，爬梯高ｌｍ，傾斜角度為８５°，每級階梯??間隔２?ｃｍ?（圖３?Ａ）。前２?ｗ大鼠進行３組／ｄ，?５次／組，組間休息２?ｍｉｎ的負重運??動，負重量為３５％自身體重；訓練第３周至第６周大鼠負重量增加為５０％自身體??重、３組／ｄ、７次／組、組間休息２?ｍｉｎ；第７周至第１０周大鼠負重量為自身體重的??７０％、３組／ｄ、１０次／組、組間休息２?ｍｉｎ。其余大鼠不進行運動千預。１０?ｗ后Ｓｈａｍ??組和ＯＶＸ組各取６只大鼠，ＯＥＸ組和ＯＥＵ組各�。持淮笫筇幩溃羧⊙搴徒M??織以待檢測。其余大鼠，對右側股骨進行骨損傷模型構建，模型構建成功后，ＯＵＳ??組和０￡１］組進行［１？１３３治療干預，每天干預２〇１１１丨１１，６＜１＾，持續(xù)３？，超聲波治??療儀的超聲波強度為３０?ｍＷ／ｃｍ２，占空比為２０％，超聲波中心頻率為１．５?ＭＨｚ，??脈沖頻率為丨ｋＨｚ［９４］（圖３?Ｂ）。??癒羅??圖３運動裝置和超聲治療儀器。（Ａ）負重爬梯訓練裝置；（Ｂ）超聲治療儀。??１９??
【參考文獻】

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本文編號：2862786