【摘要】：行進運動(locomotion)是脊椎動物的一種基本運動形式,其主要特點是通過肢體周期性和節(jié)律性地運動使軀體產(chǎn)生位移。行進運動由位于中腦的運動中樞(Mesencephalic Locomotor Region,MLR)誘導(dǎo)和控制,由分布于脊髓系統(tǒng)中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)群執(zhí)行和操作,這個網(wǎng)絡(luò)群稱為中樞模式發(fā)生器(Central Pattern Generator,CPG)。研究發(fā)現(xiàn),腦干5-HT神經(jīng)元對行進運動的引發(fā)和形成發(fā)揮重要的作用,其原因是由于5-HT神經(jīng)元所釋放的5-HT神經(jīng)遞質(zhì)在行進運動中扮演著重要的調(diào)控作用。持續(xù)內(nèi)向電流(Persistent Inward Current,PIC)作為一種電壓門控的離子電流,存在于多種類型的神經(jīng)元中并具有多種功能。系統(tǒng)研究5-HT神經(jīng)元中PIC的特性對揭示5-HT神經(jīng)元在行進運動中的作用具有重要的意義。先前有關(guān)PIC的研究大多集中在脊髓中與運動有關(guān)的運動神經(jīng)元和中間神經(jīng)元,但關(guān)于腦干延髓5-HT神經(jīng)元PIC的電生理特性的系統(tǒng)研究鮮有報道。鑒于此,本文使用ePet-EYFP轉(zhuǎn)基因小鼠模型和全細胞膜片鉗技術(shù),系統(tǒng)研究腦干延髓5-HT神經(jīng)元的PIC電生理特性,并進一步研究神經(jīng)遞質(zhì)五羥色胺對腦干延髓5-HT神經(jīng)元PIC的調(diào)節(jié)作用。研究表明,位于延髓椎體旁側(cè)區(qū)域(Parapyramidal Region,PPR)和中縫核群(Midline Raphe Nuclei,MRN)的5-HT神經(jīng)元PIC均包含有對tetrodotoxin(TTX)敏感的鈉離子電流(Na-PIC)和對dihydropyridine(DHP)敏感的鈣離子電流(Ca-PIC);五羥色胺對PIC及其不同離子成分的電流具有不同程度的增強性調(diào)節(jié)作用。本研究有助于我們理解PIC對腦干延髓5-HT神經(jīng)元興奮性調(diào)控的離子通道機制,加深我們對行進運動內(nèi)在機制的認(rèn)識。研究腦干PPR和MRN區(qū)域的5-HT神經(jīng)元的PIC,探究其特性與位置分布的關(guān)系以及進一步觀察其藥理學(xué)特性和神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)控特性,有助于提高我們對行進運動產(chǎn)生、協(xié)調(diào)和控制機制的認(rèn)識。目的:本文使用ePet-EYFP轉(zhuǎn)基因小鼠模型和全細胞膜片鉗技術(shù),研究持續(xù)內(nèi)向電流PIC在腦干延髓PPR和MRN區(qū)域5-HT神經(jīng)元中的電生理特性;探究腦干延髓中表達PIC的5-HT神經(jīng)元位置分布與PIC電生理特性之間的關(guān)系;測試加入阻斷劑TTX或DHP后PIC的變化情況;觀察神經(jīng)遞質(zhì)5-HT對腦干5-HT神經(jīng)元的PIC、Ca-PIC和Na-PIC的調(diào)節(jié)作用。本研究有助于解釋PIC及5-HT系統(tǒng)對運動控制的潛在作用,提高我們對肢體行進運動產(chǎn)生、控制和協(xié)調(diào)機制的認(rèn)識。方法:研究采用新生ePet-EYFP轉(zhuǎn)基因小鼠,雌雄不限,鼠齡為出生后1-15天。解剖小鼠獲得腦干以制備腦干切片(250微米);在熒光顯微鏡下尋找EYFP陽性的5-HT神經(jīng)元。利用全細胞膜片鉗技術(shù),在電壓鉗模式下記錄PIC;分析激活電壓(V_o)、峰值電壓(V_p)、PIC幅度(Amplitude)。研究加入鈉通道阻斷劑(TTX)或鈣通道阻斷劑(DHP)后PIC的生物物理學(xué)特性變化,包括V_o、V_p、Amplitude等指標(biāo),以及神經(jīng)遞質(zhì)5-HT對不同類型PIC電生理特性的調(diào)節(jié)。結(jié)果:(1)腦干延髓5-HT神經(jīng)元分布在PPR和MRN區(qū)域。(2)本實驗共記錄195個5-HT神經(jīng)元,其中169個細胞表達PIC(86.7%)。測試PPR區(qū)域的5-HT神經(jīng)元83個,有70個細胞表達PIC(84.3%),MRN區(qū)域5-HT神經(jīng)元112個,99個細胞表達PIC(88.4%)。(3)實驗觀察到5-HT神經(jīng)元表現(xiàn)出5種類型的PIC,分別為:a-PIC(65.5%)、2a-PIC(20.2%)、d-PIC(4.8%)、ad-PIC(7.1%)、3a-PIC(2.%)。(4)PIC的生物物理學(xué)參數(shù)(n=51):V_o(-19.8±6mV)、V_p(-0.5±3.3mV)、Amplitude(220.8±81.9pA)。按位置劃分PIC:椎體旁側(cè)的5-HT神經(jīng)元PIC(n=19):V_o(-17.4±3.7mV)、V_p(1.3±2.5mV)、Amplitude(210.6±68.4pA)。中縫核群的5-HT神經(jīng)元PIC(n=32):V_o(-19.5±7.3m V)、V_p(-0.7±4.2mV)、Amplitude(213.4±86pA)。PPR和MRN區(qū)域5-HT神經(jīng)的PIC在V_o、V_p和幅度上均沒有顯著性差異(P0.05)。(5)PIC由電壓敏感的鈉電流(Na-PIC)和電壓敏感的鈣電流(Ca-PIC)兩種電流組成。實驗條件下,在記錄PIC的溶液中加入1—2μM TTX可得Ca-PIC。其中在所測的10個5-HT神經(jīng)元中,PIC的V_o(-15.7±5.8 mV)、V_p(3.2±6.5 mV)、Amplitude(268.2±123.8 pA),加入TTX后Ca-PIC的V_o(-15.5±2.9 mV)、V_p(0.8±7mV)、Amplitude(225±102 pA)。實驗條件下,加入20—30μM DHP可得Na-PIC。在所測的15個5-HT神經(jīng)元中,PIC的V_o(-17.7±5.4 mV)、V_p(-0.8±4.3mV)、Amplitude(270.8±75.4pA),加入DHP后Na-PIC的V_o(-17.2±3.7mV)、V_p(-2.3±2.8mV)、Amplitude(204±48.2 pA)。加入TTX或者DHP降低電流幅度及去極化激活電壓。但結(jié)果表明:同一個細胞的PIC與Na-PIC及Ca-PIC在電流幅度上存在顯著性差異(P0.05)。(6)5-HT對PIC的調(diào)節(jié)(n=9):實驗所用的5-HT濃度為15—20μM。5-HT增加PIC幅度從185.2±71.5 pA到271.4±91.5 pA(P0.05),激活電壓V_O超極化從-19.7±7.5 mV到-23.6±7.2 mV(P0.05)。5-HT對椎體旁側(cè)5羥色胺神經(jīng)元PIC的調(diào)節(jié)更為顯著(n=4),主要體現(xiàn)在激活電壓和電流幅度(P0.05)。5-HT對中縫核群5-HT神經(jīng)元PIC的電生理調(diào)節(jié)無顯著性變化(P0.05,n=5)。(7)5-HT對Na-PIC的調(diào)節(jié)(n=9):5-HT增加Na-PIC的幅度從201.6±62pA到287±64.1pA,但與對照組比較沒有顯著性差異(p0.05)。激活電壓超極化從-17.8±3.2mV到-22.3±1.9mV,且與對照組比較具有顯著性差異(p0.05)。5-HT對Ca-PIC的調(diào)節(jié)(n=14):5-HT增加Ca-PIC的幅度從194.3±91.2pA到258.3±149pA(p0.05),激活電壓從-20.8±5mV到-24.3±8.9m V(p0.05)。結(jié)論:(1)在ePet-EYFP小鼠腦干延髓5-HT神經(jīng)元中,PIC是普遍表達的且與分布位置(PPR、MRN)無關(guān),PIC包含有對tetrodotoxin(TTX)敏感的鈉離子電流(Na-PIC)和對dihydropyridine(DHP)敏感的鈣離子電流(Ca-PIC)。(2)椎體旁側(cè)(PPR)和中縫核群(MRN)的5-HT神經(jīng)元PIC電生理特性沒有顯著性差異,但PPR區(qū)域的5-HT神經(jīng)元對神經(jīng)遞質(zhì)5-HT的調(diào)節(jié)更為敏感,這一特性可能與PPR位置的5-HT神經(jīng)元在行進運動中的重要作用有關(guān)。(3)作為中樞系統(tǒng)中一種重要的神經(jīng)遞質(zhì),本研究顯示5-HT可增加PIC幅度,超極化激活電壓,表明5-HT可提高神經(jīng)元興奮性。這種神經(jīng)調(diào)控機制可能在行進運動中扮演重要作用。(4)5-HT可增強腦干延髓5-HT神經(jīng)元的Ca-PIC和Na-PIC,且調(diào)節(jié)機制不同。
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：G804.2
【圖文】：

在計算 PIC 的各種電生理參數(shù)前，從記錄得到的 PIC 圖可用于分析。在給予電壓的上升支引發(fā)的 PIC 用于計算持續(xù)內(nèi)向電黑色線代表原始圖形，紅色線為處理過電流曲線。滲漏電流減后，電直線，其與水平線軌跡相切的最后一點定義為產(chǎn)生 PIC 的起始點：應(yīng)的電壓為 V0。電流曲線的最低點定義為 PIC 的峰值：IP，其所對幅度定義為 IP與 I0的差值，即 PIC=I0-IP。標(biāo)記細胞胞電生理測試的同時，向記錄電極內(nèi)注入 0.5 1% 黃色yellow ）用于標(biāo)記 5-HT 神經(jīng)元。電生理實驗結(jié)束后，將標(biāo)片放置于 4%的多聚甲醛溶液中浸泡 2 小時，之后用 PB凈，再移至載玻片到自然風(fēng)干，最后用熒光固化劑處理切

實驗中用于計算生物物理學(xué)參數(shù)的 PIC 圖像的選取標(biāo)準(zhǔn)：電流幅度>20pA，胞滲流電流<100pA，干擾小，PIC 曲線比較穩(wěn)定即震蕩小。本文主要分為三大分，首先描述 5-HT 神經(jīng)元在腦干分布以及 PIC 在 5-HT 神經(jīng)元不同區(qū)域的表狀況。其次，根據(jù) PIC 組成成分的不同，通過加入鈉通道阻斷劑 TTX 或鈣通阻斷劑 DHP 將 PIC 進一步劃分為 Ca-PIC 和 Na-PIC，并研究不同類型 PIC 的生理特性。最后，探究神經(jīng)遞質(zhì) 5-HT 對 PIC、Ca-PIC、Na-PIC 的調(diào)節(jié)作用。1 腦干 5-HT 神經(jīng)元的分布本文研究的是腦干下行 5-HT 神經(jīng)元，主要是指腦干延髓區(qū)域的 5-HT 神經(jīng)，即 a-b 之間的腦干組織（圖 2 為腦干標(biāo)本示意圖）。實驗條件下將腦干延髓行振動切片，大致可切 4-5 片（每片厚度 250μM）。將切片放置于熒光顯微下，可觀察到腦干延髓的 5-HT 神經(jīng)元分布在 PPR 和 MRN 區(qū)域（圖 3）。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 劉少雄;許鹿希;;大鼠腦干5-羥色胺神經(jīng)元的分布——免疫細胞化學(xué)研究和定量分析[J];神經(jīng)解剖學(xué)雜志;1987年02期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 楊勝魁;ePet-EYFP小鼠腦干下行五羥色胺神經(jīng)元電生理學(xué)、形態(tài)學(xué)及神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)控性研究[D];華東師范大學(xué);2016年

本文編號：2740865