【摘要】：研究目的:本研究以C2C12成肌細(xì)胞為研究對(duì)象,利用外源性叔丁基過氧化氫孵育制備氧化應(yīng)激細(xì)胞模型,觀察成肌分化進(jìn)程中線粒體穩(wěn)態(tài)及生物鐘相關(guān)蛋白表達(dá)的動(dòng)態(tài)規(guī)律,以探討氧化應(yīng)激對(duì)成肌分化進(jìn)程中線粒體生物節(jié)律的調(diào)控機(jī)制。并對(duì)線粒體穩(wěn)態(tài)進(jìn)行干預(yù),擬驗(yàn)證線粒體是否可逆向調(diào)控生物鐘。研究方法:(1)外源性的叔丁基過氧化氫(t-BHP)在不同濃度梯度(0μM、20μM、40μM、60μM、80μM、100μM、120μM)作用C2C12成肌細(xì)胞的條件摸索,MDA含量測(cè)定評(píng)價(jià)細(xì)胞氧化應(yīng)激水平,從而確定造成氧化應(yīng)激的t-BHP濃度。(2)外源性t-BHP調(diào)控成肌分化進(jìn)程中線粒體穩(wěn)態(tài)生物節(jié)律實(shí)驗(yàn):C2C12成肌細(xì)胞分為control組和t-BHP treated組,加入馬血清啟動(dòng)成肌分化,t-BHP treated組細(xì)胞在分化起始時(shí)加入100μM的t-BHP,將分化開始后的48h定義為ZT0,分別在ZT0,ZT4,ZT8,ZT12,ZT16,ZT20和ZT24收集細(xì)胞檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。Western-blotting檢測(cè)Mfn2,OPA1,Drp1,COXIV,PGC-1α及Bmal1蛋白表達(dá)水平,熒光定量PCR檢測(cè)MyoD mRNA表達(dá)。(3)線粒體穩(wěn)態(tài)干預(yù)實(shí)驗(yàn):C2C12成肌細(xì)胞分為4組:空質(zhì)粒對(duì)照組、OPA1 siRNA組;DMSO對(duì)照組、Drp1抑制劑組。加入馬血清啟動(dòng)成肌分化對(duì)C2C12成肌細(xì)胞進(jìn)行分化和叔丁基過氧化氫孵育,在分化開始后的48h定義為ZT0,每4個(gè)小時(shí)進(jìn)行細(xì)胞收集一次,分別為ZT0,ZT4,ZT8,ZT12,ZT16,ZT20,ZT24。實(shí)驗(yàn)分組:control組和t-BHPtreated組;Western-blotting檢測(cè)Mfn2,OPA1,Drp1,COXIV,PGC-1α及生物鐘Bmal1表達(dá),熒光定量PCR成肌分化MyoD的表達(dá)。分化開始時(shí),空質(zhì)粒對(duì)照組加入空白干擾片段,OPA1 siRNA組加入OPA1siRNA干擾片段,DMSO對(duì)照組加入DMSO溶液、Drp1抑制劑組加入50μM的Mdivi1。分化48 h時(shí)收集細(xì)胞檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。Western-blotting檢測(cè)OPA1,Drp1及Bmal1蛋白表達(dá)。熒光定量PCR檢測(cè)MyoD和PGC-1α,線粒體力能學(xué)檢測(cè)活性氧和膜電位。研究結(jié)果:(1)在外源性t-BHP調(diào)控成肌分化進(jìn)程中線粒體生節(jié)律實(shí)驗(yàn)中,JTK-CYCLE算法分析結(jié)果表明,對(duì)照組(MnSOD,Mfn2,OPA1,L-OPA1,S-OPA1,Drp1,COXIV,PGC-1α,OMA1及Bmal1)蛋白表達(dá)和MyoD的基因水平表達(dá)均具有顯著生物節(jié)律,MnSOD,OPA1,COXIV,PGC-1α,OMA1,S-OPA1,蛋白表達(dá),MyoD的基因水平表達(dá)均表現(xiàn)為波峰值顯著高于均值(p0.05),Drp1,L-OPA1,OMA1,Drp1及Bmal1的蛋白表達(dá)均出現(xiàn)波谷值顯著低于均值(p0.05),MyoD的基因水平表達(dá)與MnSOD,Mfn2,OPA1,L-OPA1,S-OPA1,OMA1,Drp1,COXIV,PGC-1α及Bmal1的蛋白水平表達(dá)均出現(xiàn)波谷值顯著低于波峰值(p0.05)。t-BHP treated組(MyoD的基因水平表達(dá),MnSOD,Mfn2,OPA1,L-OPA1,S-OPA1,OMA1,Drp1,COXIV,PGC-1α及Bmal1的蛋白表達(dá))未表現(xiàn)顯著生物節(jié)律,MyoD的基因水平表達(dá),MnSOD,Mfn2,OPA1,L-OPA1,S-OPA1,OMA1,Drp1,COXIV,PGC-1α及Bmal1的蛋白表達(dá)表現(xiàn)為波峰、波谷和均值間比較無顯著差異(p0.05)。與對(duì)照組比較,t-BHP treated組(MyoD的基因水平表達(dá),MnSOD,Mfn2,OPA1,L-OPA1,S-OPA1,OMA1,Drp1,COXIV,PGC-1α及Bmal1的蛋白表達(dá)的總表達(dá)量顯著降低(p0.05~0.01)。(2)在線粒體穩(wěn)態(tài)干預(yù)實(shí)驗(yàn)中,與空質(zhì)粒組比較,OPA1 siRNA組活性氧是顯著升高(p0.05),膜電位(p0.05~0.01),PGC-1α,MyoD的基因水平以及蛋白Bmal1,OPA1,Drp1的蛋白表達(dá)水平表達(dá)顯著降低(p0.05)。與DMSO對(duì)照組,Drp1抑制劑組膜電位顯著升高(p0.05~0.01),MyoD的基因水平和蛋白Bmal1的水平表達(dá)并無顯著變化(p0.05),PGC-1α的基因水平和活性氧顯著下降(p0.05)。研究結(jié)論:1.C2C12細(xì)胞成肌分化進(jìn)程中,線粒體穩(wěn)態(tài)(生物合成、融合/分裂)和成肌分化相關(guān)因子表達(dá)呈顯著生物節(jié)律。2.本研究利用外源性叔丁基過氧化氫孵育建立C2C12細(xì)胞氧化應(yīng)激模型,證明氧化應(yīng)激導(dǎo)致成肌分化進(jìn)程中線粒體穩(wěn)態(tài)生物節(jié)律異�；蛳�。3.本研究利用OPA1 siRNA和Drp1抑制劑建立C2C12細(xì)胞線粒體穩(wěn)態(tài)干預(yù)模型,證明線粒體穩(wěn)態(tài)障礙抑制生物鐘基因表達(dá),具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
【圖文】：

豎直安靜 2min，離心轉(zhuǎn)速 1 步驟重復(fù)離心，轉(zhuǎn)速為 1 萬轉(zhuǎn)，3min，之后重復(fù)上述棄掉廢液，之后離心兩分鐘，轉(zhuǎn)速為一萬轉(zhuǎn)入吸附柱，在吸附柱的膜中央加入 40 微升 3 分鐘后，在冰上靜止放置 5 分鐘，，放于負(fù)性檢測(cè)糖凝膠電泳電壓 110V 36min,每孔加入 6μl圖 2-2 所示 28s 和 18s 的帶是非常清晰顯著紫外分光光度計(jì)上檢測(cè)到波長(zhǎng)為260納米和 OD 值處于 1.7 到 2.1 之間是可以用于逆轉(zhuǎn)

圖 3-1 叔丁基過氧化氫與細(xì)胞存活率關(guān)系叔丁基過氧化氫與細(xì)胞存活率關(guān)系（Mean ± SD. *P<0.05, **P<0.01）濃度梯度（0μM、20μM、40μM、60μM、80μM、100μM化氫孵育 C2C12 細(xì)胞在 72h 之后處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)成肌細(xì) 濃度的叔丁基過氧化氫在 72h 處理之后，與對(duì)照組 0h 相，當(dāng) 120μM 時(shí)出現(xiàn)顯著性差異變化，C2C12 成肌細(xì)胞受擊，增殖活性明顯受到抑制，呈現(xiàn)出明顯的降低趨勢(shì)。雖氧化氫沒有明顯的造成成肌細(xì)胞的增殖變化，但是可能造，在 120μM 時(shí)出現(xiàn)嚴(yán)重的氧化損傷。（圖 3-1）
【學(xué)位授予單位】：天津體育學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：G804.6

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3 高Z

本文編號(hào)：2705750