【摘要】：目的:調(diào)控C2C12細(xì)胞內(nèi)PHB1的含量,確認(rèn)PHB1對(duì)F0F1-ATP酶含量及其合成活性的影響;觀察PHB1對(duì)細(xì)胞能量代謝、氧化應(yīng)激(ROS)、ATP含量的影響。為下一步研究PHB1調(diào)控細(xì)胞內(nèi)F0F1-ATP酶的作用機(jī)制及對(duì)運(yùn)動(dòng)能力的影響,揭示運(yùn)動(dòng)時(shí)線粒體自身調(diào)節(jié)的分子機(jī)制,以及探尋PHB1是否能夠作為調(diào)控能量代謝分子靶點(diǎn)提供科學(xué)依據(jù)。方法:構(gòu)建PHB1高表達(dá)和RNA干擾腺病毒載體,建立完整的C2C12細(xì)胞系培養(yǎng)體系。將PHB1高表達(dá)和RNA干擾腺病毒載體轉(zhuǎn)染進(jìn)小鼠成肌細(xì)胞C2C12內(nèi),最佳轉(zhuǎn)染條件的摸索及確定PHB1的轉(zhuǎn)染效果。利用熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)熒光分布情況,采用流式細(xì)胞儀確定C2C12細(xì)胞中PHB1轉(zhuǎn)染效率高低;并采用Western blot檢測(cè)細(xì)胞中PHB1表達(dá)水平的變化,確認(rèn)兩種載體在細(xì)胞中對(duì)PHB1表達(dá)升高和抑制的效果。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)升高或降低細(xì)胞中PHB1的表達(dá)后,細(xì)胞中F0F1-ATP酶mRNA水平變化;采用Western blot觀察升高和降低C2C12細(xì)胞中PHB1的表達(dá)后,F0F1-ATP酶蛋白表達(dá)水平的變化。升高和降低C2C12細(xì)胞中PHB1的表達(dá)后,采用線粒體呼吸鏈復(fù)合物V活性試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中F0F1-ATP酶合成活性的變化;采用活性氧(ROS)測(cè)試盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS變化;采用ATP含量試劑盒檢測(cè)C2C12細(xì)胞內(nèi)ATP含量的變化;采用XF細(xì)胞線粒體應(yīng)激檢測(cè)試劑盒檢測(cè)C2C12細(xì)胞耗氧率(OCR)變化。結(jié)果:1.腺病毒載體(Ad-GFP)轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞,最佳轉(zhuǎn)染條件為MOI=150,48h2.腺病毒高表達(dá)載體Ad-phb1轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞,PHB1的表達(dá)水平明顯升高;RNA干擾載體Ad-phb1 shRNA轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞,PHB1的表達(dá)水平明顯降低。3.與對(duì)照組相比,外源性升高PHB1表達(dá),C2C12細(xì)胞中FOF1-ATP酶mRNA水平和F0F1-ATP酶蛋白表達(dá)水平均明顯升高;與對(duì)照組相比,外源性降低PHB1表達(dá),C2C12細(xì)胞中FOF1-ATP酶mRNA水平和F0F1-ATP酶蛋白表達(dá)水平均明顯降低。4.與對(duì)照組相比,外源性升高PHB1的表達(dá),C2C12細(xì)胞中F0F1-ATP合成酶活性顯著升高;與對(duì)照組相比,外源性降低PHB1的表達(dá),C2C12細(xì)胞中F0F1-ATP合成酶性顯著降低。5.與對(duì)照組相比,外源性升高PHB1的表達(dá),C2C12細(xì)胞中ATP含量和細(xì)胞耗氧率(OCR)顯著增高,細(xì)胞呼吸功能顯著增強(qiáng),細(xì)胞能量代謝增強(qiáng);與對(duì)照相組比,外源性降低C2C12細(xì)胞內(nèi)PHB1的表達(dá),ATP含量和細(xì)胞耗氧率(OCR)顯著降低,細(xì)胞呼吸功能顯著降低,細(xì)胞能量代謝減弱。6.與對(duì)照組相比,外源性升高PHB1的表達(dá),C2C12細(xì)胞中ROS生成顯著降低;與對(duì)照組相比,外源性降低PHB1的表達(dá),C2C12細(xì)胞中ROS生成顯著升高。結(jié)論:1.通過(guò)調(diào)控PHB1的表達(dá),發(fā)現(xiàn)PHB1可以使F0F1-ATP合酶的表達(dá)及活性升高,從而促進(jìn)細(xì)胞能量代謝的增強(qiáng)。2.通過(guò)調(diào)控PHB1的表達(dá),使得細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生減少,表明PHB1可能與穩(wěn)定線粒體結(jié)構(gòu)有關(guān)。
[Abstract]:Aim: to regulate the content of PHB1 in C2C12 cells, to confirm the effect of PHB1 on the content and synthesis of F0F1-ATP, and to observe the effect of PHB1 on cell energy metabolism and (ROS) content under oxidative stress. In order to further study the mechanism of PHB1 regulating intracellular F0F1-ATP enzyme and its effect on motor ability, to reveal the molecular mechanism of mitochondrial self-regulation during exercise, and to explore whether PHB1 can be used as a molecular target to regulate energy metabolism. Methods: the high expression of PHB1 and RNA interfering adenovirus vector were constructed and the complete culture system of C2C12 cell line was established. The high expression of PHB1 and RNA interference adenovirus vector were transfected into mouse myoblast C2C12. The optimal transfection conditions were explored and the transfection effect of PHB1 was determined. The fluorescence distribution in cells was observed by fluorescence inverted microscope, the transfection efficiency of PHB1 in C2C12 cells was determined by flow cytometry, and the changes of PHB1 expression in C2C12 cells were detected by Western blot. To confirm the effect of the two vectors on the increase and inhibition of PHB1 expression in cells. Real time fluorescence quantitative PCR was used to detect the changes of mRNA level of F0F1-ATP enzyme after increasing or decreasing the expression of PHB1 in C2C12 cells, and Western blot was used to observe the changes of F0F1-ATPase protein expression in C2C12 cells after increasing and decreasing the expression of PHB1. After increasing and decreasing the expression of PHB1 in C2C12 cells, mitochondrial respiratory chain complex V activity kit was used to detect the activity of F0F1-ATP synthesis, and reactive oxygen species (ROS) kit was used to detect the changes of ROS in cells. The changes of ATP content in C2C12 cells were detected by ATP assay kit, and the changes of C2C12 cell oxygen consumption rate (OCR) were detected by XF cell mitochondrial stress assay kit. The result is 1: 1. Adenovirus vector (Ad-GFP) was used to transfect C2C12 cells. The expression level of PHB1 in C2C12 cells transfected with adenovirus overexpression vector Ad-phb1 was significantly increased. The expression level of PHB1 in C2C12 cells transfected with Ad-phb1 shRNA was significantly decreased. Compared with the control group, exogenous PHB1 increased the expression of FOF1-ATP enzyme mRNA and F0F1-ATP protein in C2C12 cells, and compared with the control group, the expression of FOF1-ATP enzyme in C2C12 cells was significantly higher than that in control group. Exogenous reduction of PHB1 expression in C2C12 cells significantly decreased the mRNA level of FOF1-ATP and the expression of F0F1-ATP protein in C2C12 cells. Compared with the control group, exogenous increased the expression of PHB1 in C2C12 cells and significantly increased the activity of F0F1-ATP synthase in C2C12 cells, while exogenous decreased the expression of PHB1 in C2C12 cells. Compared with the control group, exogenous PHB1 increased the ATP content and cell oxygen consumption rate (OCR) in C2C12 cells, the respiratory function and energy metabolism of C2C12 cells were significantly increased, compared with those in the radiographic group. Exogenous reduction of PHB1 expression in C2C12 cells and cell oxygen consumption rate (OCR) decreased significantly, cell respiratory function decreased significantly, cell energy metabolism weakened .6. Compared with the control group, exogenous increased PHB1 expression and significantly decreased ROS production in C2C12 cells, while exogenous decreased PHB1 expression significantly increased ROS production in C2C12 cells. Conclusion 1. By regulating the expression of PHB1, it was found that PHB1 could increase the expression and activity of F0F1-ATP synthase, thus promoting the enhancement of cell energy metabolism. By regulating the expression of PHB1, the production of ROS was reduced, which suggested that PHB1 might be related to the stabilization of mitochondrial structure.
【學(xué)位授予單位】：天津體育學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：G804.7

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本文編號(hào)：2185394