人中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL)與炎癥、胚胎發(fā)育、免疫應(yīng)答、趨化作用、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展等過程密切相關(guān),是新的早期腎損傷生化標(biāo)志物。本研究旨在應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)篩選NGAL特異性抗體,并建立免疫膠體金檢測技術(shù),為體內(nèi)NGAL變化水平的檢測提供方法,為急性腎損傷的診斷提供幫助。本論文采用免疫的Balb/C小鼠,從其脾臟中提取總RNA,以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板,通過設(shè)計(jì)的簡并引物來擴(kuò)增輕鏈可變區(qū)(VL)和重鏈可變區(qū)(VH),經(jīng)過重疊延伸PCR方法連接為單鏈抗體基因(scFv)。經(jīng)sfiI、Xbal雙酶切后連接到噬菌體載體pCantab5E中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGl成功構(gòu)建了庫容為5×107pfu的鼠源噬菌體抗體庫。經(jīng)過PCR檢測,抗體庫的插入率為85%。隨機(jī)挑取部分單克隆測序分析發(fā)現(xiàn)抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)序列均不相同,說明了本研究構(gòu)建的鼠源噬菌體抗體庫多樣性較好。以重組蛋白NGAL作為靶蛋白對(duì)噬菌體抗體庫進(jìn)行了四輪富集,從第四輪篩選后的抗性平板上挑取了30個(gè)單克隆進(jìn)行了噬菌體抗體ELISA鑒定,將陽性克隆構(gòu)建CHO細(xì)胞表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中并進(jìn)行壓力篩選、重組表達(dá),對(duì)表達(dá)純化后的抗體進(jìn)行了SDS-PAGE、ELISA效價(jià)及親和力分析。結(jié)果表明,單克隆有11個(gè)為強(qiáng)陽性。ELISA測定抗體效價(jià)為1:107,抗體親和力為6.532×10-9M。表明本論文成功獲得了NGAL基因工程抗體,為NGAL檢測診斷方法的建立提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。應(yīng)用重組表達(dá)的抗體與實(shí)驗(yàn)室制備的多抗,建立了NGAL免疫膠體金檢測方法。確定了免疫膠體金層析方法最優(yōu)條件：金標(biāo)抗體標(biāo)記量12μg/mL,金標(biāo)抗體的穩(wěn)定劑為0.08%的PEG-20000,金標(biāo)抗體的保存液為20 mM pH 8.2硼酸緩沖液(含0.01%Na2N3、0.08% PEG-20000);結(jié)合墊處理液為20 mM pH 9.0 Tris-HCl(含0.5% PVP-40、0.5% Trion)、樣品墊處理液為0.01 mol/L pH 7.4 TBS(含1% BSA、0.05% Tween20)、金標(biāo)抗體噴涂量為0.5μL/mL、羊抗NGAL抗體噴涂量為1.2μL/mL、羊抗人的IgG噴涂量為4μL/mL。將試紙條分別置于37℃及4℃密封干燥避光保存,到第20周其敏感性和特異性均沒有降低。使用該試紙條對(duì)40份臨床樣本進(jìn)行了檢測,結(jié)果與臨床檢測結(jié)果完全一致。上述結(jié)果表明,本論文建立的免疫膠體金檢測方法的穩(wěn)定性、特異性較高,在臨床樣品檢測上有較高的價(jià)值。
【學(xué)位單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R446.6
【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 NGAL簡介
    1.2 基因工程抗體簡介
        1.2.1 基因工作抗體的種類
        1.2.2 基因工程抗體的表達(dá)系統(tǒng)
    1.3 噬菌體抗體庫技術(shù)及其應(yīng)用的研究進(jìn)展
        1.3.1 噬茵體抗體庫技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)
        1.3.2 噬菌體抗體的分類
        1.3.3 目標(biāo)抗體的篩選與表達(dá)
        1.3.4 噬菌體抗體庫技術(shù)應(yīng)用的研究進(jìn)展
    1.4 免疫膠體金技術(shù)概述
        1.4.1 免疫膠體金技術(shù)的基本原理
        1.4.2 免疫膠體金技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)
    1.5 本研究的目的和意義
第二章 NGAL噬菌體抗體庫的構(gòu)建
    2.1 引言
    2.2 試劑與儀器
        2.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑及材料
        2.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器
    2.3 試驗(yàn)方法
        2.3.1 BALB/c鼠免疫
        2.3.2 小鼠脾臟總RNA提取
        2.3.3 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA
        2.3.4 PCR擴(kuò)增小鼠抗體輕鏈、重鏈基因
        2.3.5 ScFv的PCR擴(kuò)增
        2.3.6 ScFv基因與載體pCantab5E酶切
        2.3.7 抗體基因ScFv與載體pCantab5E連接
        2.3.8 連接產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化
        2.3.9 噬菌體抗體庫重組率鑒定和多樣性分析
    2.4 試驗(yàn)結(jié)果
        2.4.1 NGAL蛋白免疫小鼠血清效價(jià)測定
        2.4.2 小鼠脾臟RNA提取
        2.4.3 小鼠抗體VH和VL PCR擴(kuò)增
        2.4.4 ScFv基因PCR拼接
        2.4.5 NGAL小鼠噬菌體抗體庫庫容
        2.4.6 噬菌體抗體庫的插入率及多樣性分析
    2.5 本章小結(jié)
第三章 NGAL噬菌體抗體庫的篩選及抗體表達(dá)
    3.1 引言
    3.2 試劑與儀器
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑及材料
        3.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器
    3.3 試驗(yàn)方法
        3.3.1 噬菌體表面展示抗體庫的制備
        3.3.2 NGAL噬菌體抗體庫的篩選
        3.3.3 ELISA鑒定重組噬菌體單克隆
        3.3.4 陽性克隆序列分析
        3.3.5 重組抗體真核表達(dá)載體構(gòu)建
        3.3.6 表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化CHO細(xì)胞
        3.3.7 雙抗夾心ELISA方法檢測重組抗體的表達(dá)
        3.3.8 重組抗體的純化
        3.3.9 純化抗體的SDS-PAGE鑒定
        3.3.10 ELISA鑒定純化后抗體活性
        3.3.11 親和力測定
    3.4 試驗(yàn)結(jié)果
        3.4.1 NGAL噬菌體抗體庫的富集
        3.4.2 噬菌體單克隆鑒定
        3.4.3 噬菌體抗體基因序列
        3.4.4 抗體基因表達(dá)載體構(gòu)建
        3.4.5 ELISA鑒定細(xì)胞表達(dá)上清
        3.4.6 純化抗體SDS-PAGE鑒定
        3.4.7 純化抗體的活性鑒定
        3.4.8 純化抗體的活性鑒定
    3.5 本章小結(jié)
第四章 NGAL基因工程抗體在免疫膠體金檢測方法中的應(yīng)用
    4.1 引言
    4.2 試劑與儀器
        4.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑及材料
        4.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器
    4.3 試驗(yàn)方法
        4.3.1 金標(biāo)抗體的制備與純化
        4.3.2 結(jié)合墊、樣品墊的預(yù)處理
        4.3.3 金墊的制備及抗體噴涂
        4.3.4 免疫膠體金測試條的組裝
        4.3.5 免疫膠體金層析法各種最佳條件的選擇
        4.3.6 測試方法與評(píng)判
        4.3.7 特異性試驗(yàn)
        4.3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)
        4.3.9 對(duì)臨床樣品的檢測
    4.4 試驗(yàn)結(jié)果
        4.4.1 免疫膠體金層析法各種最佳條件的選擇
        4.4.2 特異性試驗(yàn)
        4.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)
        4.4.4 對(duì)臨床樣品的檢測
    4.5 本章小結(jié)
第五章 總結(jié)和展望
    5.1 總結(jié)
    5.2 展望
參考文獻(xiàn)
碩士期間發(fā)表論文
致謝

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