【摘要】：目的：粘著斑激酶(focal adhesion kinase; FAK)是一種非受體型蛋白酪氨酸激酶(non-receptor protein tyrosine kinase),對動態(tài)調(diào)節(jié)細胞粘附結(jié)構至關重要。最近有研究顯示,FAK也存在于興奮性谷氨酸能突觸、并參與突觸可塑性的調(diào)節(jié)。然而,FAK在脊髓中樞敏感化過程中的作用仍然不清楚。細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(Extracellular signal-regulated kinases 1 and 2; ERK1/2)和N-甲基-D-天冬氨酸(N-Methyl-D-Aspartate; NMDA)型谷氨酸受體的活性與痛覺敏化密切相關。本研究的目的,在于探討FAK對脊髓背角ERK1/2的活性及NMDA受體介導的痛覺突觸傳遞的調(diào)控作用。方法：本研究通過小鼠后足底皮下注射完全弗氏佐劑(Complete Freund's Adjuvant;CFA)來創(chuàng)建疼痛模型,再通過免疫蛋白印跡、行為學測試、膜片鉗電生理學記錄、免疫組織化學等方法來探討外周炎性損傷對脊髓背角FAK信號通路的調(diào)節(jié)作用及其意義。結(jié)果：(1)免疫組織化學的結(jié)果顯示：FAK表達于痛覺調(diào)控的關鍵部位---脊髓背角神經(jīng)元中；(2)足底注射CFA后,脊髓背角FAK的第397位酪氨酸殘基(FAK-Tyr397)的磷酸化水平會顯著增加,提示：慢性炎性疼痛的形成伴隨有脊髓FAK的活化；(3)鞘內(nèi)給予NMDA受體拮抗劑D-APV (5μg)、或Ⅰ型代謝型谷氨酸受體(Group I Metabotropic glutamate receptor; Group I mGluR)拮抗劑AIDA (25μg),均能有效降低炎性疼痛小鼠FAK-Tyr397的磷酸化水平,提示：外周組織損傷可能通過激動脊髓NMDA受體和Ⅰ型mGluR受體,誘導FAK的活化；(4)為直接觀察FAK在中樞敏感化中的作用,本研究在脊髓背角過表達野生型FAK[FAK(WT)],發(fā)現(xiàn)：即使在正常小鼠,FAK(WT)也可誘發(fā)明顯的熱痛覺過敏和機械性痛覺超敏,而過表達無活性的FAK突變體--FAK(Y397F),則對正常小鼠的痛行為不會產(chǎn)生任何影響；(5)免疫印跡實驗結(jié)果顯示：FAK(WT)的一個重要作用,在于激活脊髓背角ERK1/2、顯著提高ERK1/2的磷酸化水平；鞘內(nèi)注射MEK抑制劑U-0126 (0.2μg、0.5μg和1.0 μg),能夠劑量依賴性地緩解FAK(WT)誘發(fā)的疼痛癥狀,提示：FAK可能通過ERK1/2信號通路,參與中樞敏感化的形成；(6) FAK(WT)激活的ERK1/2,能夠提高NMDA受體GluN2B、GluN1亞基在突觸小體膜結(jié)構(synaptosomal membrane fraction; P3)中的表達,而對P3中NMDA受體G1uN2A亞基、以及α-氨基-3羥基-5甲基-4異惡唑型谷氨酸(alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid; AMPA)受體GluAl亞基的表達卻沒有明顯影響；(7)CFA顯著提高脊髓背角ERK1/2的磷酸化水平,而這一作用可被FAK(Y397F)所逆轉(zhuǎn)；(8)電生理學記錄顯示：將抗FAK的特異性抗體通過記錄電極導入炎性疼痛小鼠脊髓背角Ⅱ板層神經(jīng)元后,NMDA受體介導的興奮性突觸后電流(Excitatory postsynaptic currents; EPSCs)幅值會顯著降低,而非特異性的IgG卻無此作用；(9)行為學結(jié)果顯示：脊髓背角表達FAK(Y397F)、抑制內(nèi)源性FAK的活性,能夠有效緩解CFA誘發(fā)的機械性痛覺超敏和熱痛覺過敏。結(jié)論：FAK可能通過FAK/ERK/GluN2B信號通路誘發(fā)NMDA受體的功能亢進,參與脊髓中樞敏感化的形成；直接表達無活性的FAK(Y397F)突變體能夠有效緩解慢性炎性疼痛癥狀。
【圖文】：

圖１－１人體ＦＡＫ結(jié)構示意圖逡逑ＦＡＫ邋的結(jié)構。３］包含了一個邋Ｎ－末端的邋ＦＥ民Ｍ邋（Ｆｏｕｒ－ｐｏｉｎｔ－０打ｅ，Ｅｚｒｉｎ，民ａｄｋｉｎ，逡逑Ｍｏｅｓｉｎ）結(jié)構域、一個激酶結(jié)構域（ｋｉｎａｓｅ邋ｄｏｍａｉｎ）、兩個脯氨酸富集域（ｐｒｏ邋ｌｉｎｅ－ｒｉｃｈ逡逑ｄｏｍａｉｎ）、及一個Ｃ－末端的粘著斑鞭向定位結(jié)構域（Ｆｏｃａｌ邋Ａｄｈｅｓｉｏｎ－Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ逡逑

嘸っ感藕攀怕范約顧璞辰鞘┚跬淮ゴ鄏蕕牡鶻謐饔茫]3?ｄｏｍａｉｎ；邋ＦＡＴ）（圖１－１）邋Ｍ。ＦＥＲＭ結(jié)構域負責與生長因子受體（ｇ的ｗｔｈ邋ｆａｃｔｏｒ逡逑ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）、整合素（ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ）等相互作用，將這些膜蛋白感受的細胞外信號逡逑向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)導。然而，在靜息情況下，ＦＥＲＭ結(jié)構域會與激酶結(jié)構域發(fā)生分子內(nèi)逡逑的結(jié)合，這種分子折疊導致ＦＡＫ處于無活性狀態(tài)—旦膜表面的生長因子受逡逑體、整合素Ｗ及Ｇ蛋白偶聯(lián)受體（Ｇ邋ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ邋ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）、受體型酪氨酸逡逑激酶（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｌｉｋｅ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｔｙｒｏｓｉｎｅ邋ｋｉｎａｓｅｓ）等被激抽邐細胞內(nèi)的鉤離子濃逡逑度就會大量增加，同時蛋白激酶Ｃ邋（Ｐｒｏｔｅｉｎ拉ｎａｓｅＱＰＫＣ）也會被激活ｆＷ。在逡逑巧離子和／或ＰＫＣ的作用下，ＦＡＫ就會向細胞膜定位，使得ＦＥＲＭ結(jié)構域與跨膜逡逑蛋白、信號蛋白等相互結(jié)合；這種結(jié)合，，打斷了邋ＦＥＲＭ結(jié)構域?qū)っ附Y(jié)構域的逡逑封閉，導致激酶結(jié)構域的暴露，隨后，ＦＡＫ的第３９７位酪氨酸殘基（Ｔｙｒ３９７）就逡逑會發(fā)生自身z1酸化
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R402

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本文編號：2569020