本文關(guān)鍵詞：β-catenin轉(zhuǎn)染表皮干細(xì)胞對糖尿病大鼠創(chuàng)面修復(fù)的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的： 探討體外培養(yǎng)條件下不同葡萄糖濃度對大鼠表皮干細(xì)胞（epidermal stemcells，ESCs）生長的影響，以及上調(diào)β-catenin的表達(dá)對糖尿�。―iabetes Mellitus，DM）大鼠表皮干細(xì)胞增殖分化的作用，觀察上調(diào)糖尿病大鼠表皮干細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)對創(chuàng)面愈合的影響，，為臨床糖尿病創(chuàng)面的修復(fù)治療奠定實驗基礎(chǔ)。 方法： （1）取SD大鼠背部皮膚,采用酶消化法分離表皮和真皮，Ⅳ型膠原差速貼壁法純化表皮干細(xì)胞，建立體外培養(yǎng)大鼠表皮干細(xì)胞模型，隨機(jī)分成A組(對照組，葡萄糖濃度5.5mmol/L)，B組(葡萄糖濃度10mmol/L)，C組(葡萄糖濃度20mmol/L)，D組（葡萄糖濃度40mmol/L）。顯微鏡下觀察表皮干細(xì)胞的生長情況，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測表皮干細(xì)胞中β-catenin、Wnt1的表達(dá)，使用圖像分析軟件測量陽性細(xì)胞表達(dá)的平均積分光密度值。 （2）制備糖尿病大鼠模型(腹腔一次性注射鏈脲佐菌素STZ，劑量為65mg/kg)，體外分離培養(yǎng)糖尿病大鼠表皮干細(xì)胞（ESCs），采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將pcDNA3.1myc-β-catenin質(zhì)粒轉(zhuǎn)入ESCs，同時設(shè)立脂質(zhì)體對照組(轉(zhuǎn)脂質(zhì)體)和正常對照組，48h后，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測各組表皮干細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)；Western Blot檢測轉(zhuǎn)染組與正常對照組表皮干細(xì)胞中β-catenin、Wnt1、CyclinD1的表達(dá)情況。 （3）選取成模的DM大鼠15只，分別在脊柱兩側(cè)的背部制備直徑約2.0cm的全層皮膚缺損創(chuàng)面，即每只大鼠制備四個創(chuàng)面，并隨機(jī)分為4組：A組(創(chuàng)面移植羊膜負(fù)載轉(zhuǎn)染的表皮干細(xì)胞組)，B組(創(chuàng)面移植羊膜負(fù)載未轉(zhuǎn)染表皮干細(xì)胞組)，C組(羊膜組)和D組(空白對照組,不加任何干預(yù))。觀察創(chuàng)面愈合情況并測算創(chuàng)面愈合率，采用HE染色進(jìn)行組織病理學(xué)觀察以及免疫組織化學(xué)法檢測創(chuàng)面組織中增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）的表達(dá)。 結(jié)果： （1）顯微鏡下觀察，隨著葡萄糖濃度的升高，細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，生長速度緩慢，胞體透亮度下降，活力降低；免疫細(xì)胞化學(xué)染色分析結(jié)果顯示，C組β-catenin(0.079±0.007）、Wnt1（0.083±0.004）和D組β-catenin（0.068±0.008）、Wnt1（0.070±0.006）的表達(dá)均明顯低于A組（β-catenin：0.096±0.123；Wnt1：0.095±0.010），p0.01。 （2）免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示,表皮干細(xì)胞轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后β-catenin的表達(dá)增高，其表達(dá)水平高于脂質(zhì)體組和空白對照組(p0.01)，脂質(zhì)體組和空白對照組組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（p0.05）。Western Blot檢測結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染組β-catenin、Wnt1、CyclinD1的表達(dá)均高于空白對照組(1.451±0.027vs1.094±0.026；1.084±0.078vs0.694±0.082；1.490±0.030vs0.807±0.019，p0.01）。 （3）A組創(chuàng)面與B、C、D組相比較，其愈合時間縮短且創(chuàng)面愈合率提高，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)，各組創(chuàng)面組織中均可見PCNA陽性細(xì)胞表達(dá)，A組的陽性細(xì)胞表達(dá)高于其他三組。 結(jié)論： （1）本實驗條件下高濃度葡萄糖對體外培養(yǎng)大鼠表皮干細(xì)胞的生長有抑制作用,且表皮干細(xì)胞中β-catenin、Wnt1的表達(dá)減弱。 （2）采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法可成功將pcDNA3.1myc-β-catenin重組真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的糖尿病大鼠表皮干細(xì)胞；轉(zhuǎn)染細(xì)胞β-catenin的表達(dá)增高，并伴有Wnt1、CyclinD1的表達(dá)提高。 （3）上調(diào)糖尿病大鼠表皮干細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)可以促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面的愈合。
【關(guān)鍵詞】：糖尿病 表皮干細(xì)胞 轉(zhuǎn)染 增殖分化 創(chuàng)面修復(fù)
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R473.5
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-11
• 第1章 引言11-14
• 第2章 材料和方法14-22
• 2.1 材料14-15
• 2.1.1 實驗動物14
• 2.1.2 主要試劑14-15
• 2.1.3 主要儀器15
• 2.2 實驗方法15-21
• 2.2.1 表皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)15-16
• 2.2.2 表皮干細(xì)胞的鑒定16-17
• 2.2.3 不同糖濃度培養(yǎng)后細(xì)胞免疫化學(xué)檢測17
• 2.2.4 糖尿病大鼠模型建立17
• 2.2.5 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化與提取17
• 2.2.6 細(xì)胞分組17-18
• 2.2.7 Western Blot 檢測轉(zhuǎn)染效果及 ESCs 中β-catenin、Wnt1、CyclinD1的表達(dá)18-19
• 2.2.8 羊膜的制備及負(fù)載19-20
• 2.2.9 實驗動物分組20
• 2.2.10 創(chuàng)面觀察及創(chuàng)面愈合率計算20
• 2.2.11 組織病理學(xué)觀察20-21
• 2.3 統(tǒng)計學(xué)處理21-22
• 第3章 結(jié)果22-28
• 3.1 表皮干細(xì)胞的鑒定22
• 3.2 不同葡萄糖濃度培養(yǎng)后表皮干細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果22-23
• 3.3 不同葡萄糖濃度培養(yǎng)后表皮干細(xì)胞β-catenin、Wnt1 的表達(dá)23-24
• 3.4 質(zhì)粒鑒定24-25
• 3.5 免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測β-catenin 的表達(dá)25
• 3.6 轉(zhuǎn)染組和對照組β-catenin、Wnt1、CyclinD1 蛋白的表達(dá)25-26
• 3.7 創(chuàng)面愈合情況26-27
• 3.8 組織學(xué)觀察27-28
• 第4章 討論28-32
• 4.1 糖濃度對體外培養(yǎng)表皮干細(xì)胞的影響28-29
• 4.2 上調(diào)β-catenin 的表達(dá)對糖尿病大鼠表皮干細(xì)胞增殖分化的影響29-30
• 4.3 上調(diào) ESCs 中β-catenin 的表達(dá)構(gòu)建組織工程皮膚的可行性探討30-32
• 第5章 結(jié)論及展望32-33
• 致謝33-34
• 參考文獻(xiàn)34-37
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果37-38
• 綜述38-46
• 參考文獻(xiàn)43-46

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：252352