【摘要】：李斯特菌是一類兼性厭氧、革蘭氏陽性、呈桿狀的細菌,廣泛分布于環(huán)境、食品、人和動物宿主體內(nèi)。迄今為止,李斯特菌屬包括15個種Listeria monocytogenes, Listeria innocua, Listeria ivanovii, Listeria welshimeri, Listeria seeligeri和Listeria grayi是最常見的從食品、病人和環(huán)境中分離得到的六個種,被定義為常見李斯特菌種Listeria rocourtiae, Listeria weihenstephanensis, Listeria fleischmannii, Listeria marthii, Listeria floridensis, Listeria aquatica, Listeria cornellensis, Listeria riparia和Listeria grandensis是近年來命名的新種.常分離自然環(huán)境中,被定義為稀有李斯特菌種。李斯特菌的鑒定主要依賴傳統(tǒng)方法,包括標本的增菌、分離培養(yǎng)以及后續(xù)的生化鑒定該方法耗、耗力、成本高：生化鑒定時,反應不穩(wěn)定,結果判牘主觀性強,導致鑒結果重復性差。為J了克服傳統(tǒng)鑒定方法的不足,本研究建立了一個快速、準確的多重PCR(mPCR)檢測方法。該mPCR方法包括一個屬特異性基因和五個種特異性基因,在一個反應體系中同時鑒定李斯特菌的六個常見種。運用511侏李斯特菌和15株李斯特菌(包含十五個種)進行特異性評價,所有李斯特菌株被正確分類。該方法在實驗室研究、臨床診斷及疫情爆發(fā)溯源調(diào)查中具有重要的應用價值。在單增李斯特菌的13個血清型中,4b為優(yōu)勢致病血清型,引起人類李斯特菌病暴發(fā)和散發(fā)。4b血清型分為四個業(yè)型(ECⅠ、ECⅡ、ECⅣ、non-EC),不同的亞型在屬主特異性、致病性及生物學特征上存在差異。本研究根據(jù)一個4b血清型特異基因利三個亞型特異基因,建立針對單增李斯特菌4b血清型四個亞型(ECI、ECII、ECIV、non-EC)的mPCR鑒定方法。建立的mPCR在一個反應體系中能同時鑒別ECⅠ、ECⅡ、ECⅣ、non-EC,并運用16株4b血清型單增李斯特菌進行特異性驗證,16株4b血清型單增李斯特菌可用本方法進行分型：其中ECI亞型11株,ECII亞型1株,ECIV亞型2株,非流行克降群(non-EC)2株。本方法能準確鑒定單增李斯特菌4b血清型菌株的4個亞型,可用于食品、臨床標本的病原學診斷和疫情暴發(fā)的溯源調(diào)查。單增李斯特菌根據(jù)分子特征和進化分析方法,可分為四個進化家系(Lineage Ⅰ、 Lineage Ⅱ、Lineage Ⅲ、Lineage Ⅳ)及兩個亞系(Lineage ⅢA、Lineage ⅢC)。Lineage Ⅰ可引起人類李斯特菌病的散發(fā)和暴發(fā), Lineage Ⅱ主要分布食品和環(huán)境中,Lineage Ⅲ A、Lineage ⅢC和Lineage Ⅳ 1要來自動物李斯特菌病病例和動物食品。本研究以一個單增李斯特菌種特異基因和四個家系特異基因設計引物,建立針對單增李斯特菌四個進化家系及兩個亞系的mPCR鑒定方法,運用387株單增李斯特菌進行特異性驗證,所有菌株均可用本方法進行所屬家系和亞系的分型,包括Lineage Ⅰ246株、Lineage Ⅱ123株、Lineage ⅢA4株、Lineage ⅢC13株和Lineage Ⅳ 1株。本方法能準確鑒定單增李斯特菌的四個進化家系及兩個亞系的菌株,可用于食品、臨床標本中單增李斯特菌的病原學診斷和疫情暴發(fā)時的溯源調(diào)查。相對于傳統(tǒng)的鑒定方法而言,mPCR省時、省力、檢測成本低。然而,mPCR很難對原始增菌液進行快速檢測、依賴于熱循環(huán)設備、電泳耗時以及檢測靈敏度差。介導等溫擴增技術(LAMP)作為一種新的核酸檢測手段,不依賴于設備,結果容易判讀,廣泛用于微生物領域的檢測LAMP技術針對靶序列的八個區(qū)域設計三對引物,在一小時內(nèi)擴增靶序列達109次拷貝,其特異性和敏感性都優(yōu)于Real-time PCR和PCR技術。本研究根據(jù)伊氏李斯特菌特異基因smcl設計LAMP引物,建立Listeria ivanovii-LAMP擴增技術反應條件僅需64℃水浴1小時即可,檢檢測純培養(yǎng)目的菌時,檢測下限為250fg/反應管檢測糞便模擬標本的檢測下限為8×103CFU/g。與PCR及Real-time PCR方法相比較,LAMP方法的敏感性分別高出100和10倍L. ivanovii-LAMP引物專一性的擴增伊氏李斯特菌DNA模板,非伊氏李斯特菌株不出現(xiàn)陽性擴增為了使LAMP技術更廣泛應用到診斷領域,本研究對傳統(tǒng)LAMP技術進行改進,建立多內(nèi)引物環(huán)介導恒溫擴增技術(MI-LAMP)與傳統(tǒng)LAMP技術相似,MI-LAMP技術反應條件僅需恒溫水浴1小時即可,在檢測純培養(yǎng)目的菌時,檢測下限為62.5fg/反應管,且陽性擴增僅需15分鐘。與PCR方法相比較,MI-LAMP方法的敏感性高出400倍。此外,MI-LAMP引物專一性的擴增對應的靶序列,非靶序列不出現(xiàn)假陽性擴增。LAMP作為一種恒溫擴增技術,在診斷領域的運用受限于單一靶標檢測,為了獲得多重LAMP檢測,本研究建立了MERT-LAMP技術,實現(xiàn)LAMP技術的快速,敏感及多重實時檢測。與傳統(tǒng)LAMP技術相似,MERT-LAMP技術反應條件僅需恒溫水浴1小時即可,在檢測純培養(yǎng)目的菌時,檢測下限為250fg/反應管,且陽性擴增僅需12分鐘。實現(xiàn)多重檢測和單一目標檢測時,其敏感性不受影響。與PCR為基礎方法相比較,MERT-LAMP方法比普通PCR敏感100倍,比Real-time PCR方法敏感100倍。此外,MERT-LAMP引物專一性的擴增對應的靶序列,非靶序列不出現(xiàn)假陽性擴增。為了豐富食源性病原體單增李斯特菌的診斷體系,CPA技術被用于檢測單增李斯特菌,建立L. monocytogenes-CPA擴增技術。與其他恒溫技術相似,L. monocytogenes-CPA反應條件僅需恒溫水浴1.5小時即可,然而,CPA的引物設計簡單,對靶序列保守性要求較低。在檢測純培養(yǎng)單增李斯特菌時,檢測下限為2.5 pg/反應管,最快陽性擴增需25分鐘。與PCR為基礎方法相比較,L. monocytogenes-CPA方法比普通PCR敏感10倍。此外,L. monocytogenes-CPA引物專一性的擴增對應的靶序列,非靶序列不出現(xiàn)假陽性擴增。在本研究論文中,建立了診斷李斯特菌的核酸檢測體系及具有應用價值的新型恒溫檢測技術,實現(xiàn)對李斯特菌的快速,特異,敏感及多重檢測。為食源性疾病的篩查、臨床診斷及疫情暴發(fā)溯源調(diào)查提供有價值的分子診斷技術。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國疾病預防控制中心
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R440

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本文編號：2450445