【摘要】：環(huán)境微生物是地球上種類最多、數(shù)量最大、分布最廣的生物類型,據(jù)估計,地球上存在超過1030個微生物。微生物的傳統(tǒng)研究方法主要是基于微生物純培養(yǎng)和分離,到目前為止,絕大多數(shù)微生物(99%以上)無法依靠上述方法獲得,這極大地限制了對微生物的研究。借助于高通量測序技術(shù)快速發(fā)展起來的宏基因組學,在病原體檢測中發(fā)揮著越來越重要的作用。宏基因組測序無需篩選得到各微生物群落的純培養(yǎng)物,而是直接測定樣品中所有微生物的核酸序列,這樣可避免實驗污染帶來的偏差。宏基因組學的研究主要有16S rDNA測序和全基因組測序兩種。16S rDNA測序以環(huán)境樣品中的16S rDNA為研究對象,全基因組測序(whole genome sequencing)只需直接提取出微生物基因組進行測序。本研究基于宏基因組測序,探索未知病因樣本中可能存在的致病微生物,為揭示疾病的發(fā)生和發(fā)展提供線索。我們提取10份爛腳病樣品細菌核酸,擴增16S rDNA的V1~V2高變區(qū),測序后分析其中的菌群構(gòu)成,在所有樣本中均有檢出與傷口潰爛有關(guān)的金黃色葡萄球菌和鏈球菌。16S rDNA測序有較多環(huán)節(jié)需要改進,如細菌核酸的提取、高變區(qū)的選擇、通用引物的選擇、測序平臺的選擇以及后期數(shù)據(jù)分析策略的選擇。我們試驗了七種方法對模擬樣本進行細菌核酸提取,測序后,分析模擬樣本中各種細菌的含量和相對分布,尋找一種廣譜、高效的細菌核酸提取方法。在篩查一份未知病因發(fā)熱病人的樣品時,我們測序了其中病毒的宏基因組,發(fā)現(xiàn)了一株屬于Microviridae的病毒基因組IME-16,與以往報道差異比較大,我們對其進行了注釋、進化分析以及結(jié)構(gòu)蛋白的分析,推測IME-16可能是與alphaviruses距離較遠的一支。在測序一份乙肝病人血清樣品的病毒宏基因組時,我們優(yōu)化了生物信息分析方法,加快了數(shù)據(jù)分析的速度,同時也發(fā)現(xiàn)了一些以往報道與肝炎有關(guān)的Anelloviridae病毒序列,其中共發(fā)現(xiàn)10株Torque Teno Midi Virus(TTMDV)序列和3株Torque Teno Virus(TTV)序列與以往報道的序列差異大,我們對這些序列進行注釋和進化分析,證實它們屬于新型的Anelloviridae病毒。綜上所述,我們采用宏基因組測序,篩查了一批未知病因爛腳病樣品、一份未知病因發(fā)熱血清樣品以及一份乙型肝炎病人血清樣品,發(fā)現(xiàn)了與疾病有關(guān)的致病菌以及新型病毒全基因組序列,同時,我們改進細菌基因組提取方法和數(shù)據(jù)分析方法。總之,隨著宏基因組測序方法改進和分析技術(shù)提高,宏基因組學必將在病原體檢測方面作出重大貢獻。
[Abstract]:Environmental microorganisms are the most abundant and widely distributed organisms on the earth. It is estimated that there are more than 1030 microbes on the earth. The traditional research methods of microorganisms are mainly based on the pure culture and isolation of microorganisms. Up to now, most of the microorganisms (over 99%) cannot be obtained by these methods, which greatly limits the research of microbes. Macrogenomics, which is rapidly developed by high throughput sequencing, plays a more and more important role in pathogen detection. The nucleic acid sequences of all microbes in the samples can be determined directly without screening the pure culture of each microbial community by macro genome sequencing, which can avoid the deviation caused by the experimental contamination. The study of macrogenomics mainly includes 16s rDNA sequencing and whole genome sequencing. 16s rDNA sequencing takes 16s rDNA in environmental samples as the research object. The whole genome sequencing (whole genome sequencing) only need to extract the microbial genome directly for sequencing. Based on macro genome sequencing, this study explored the possible pathogenic microorganisms in the samples of unknown etiology and provided clues for the occurrence and development of the disease. We extracted bacterial nucleic acid from 10 samples of rotting foot disease and amplified the V1~V2 hypervariable region of 16s rDNA. Staphylococcus aureus and Streptococcus streptococcus associated with wound ulceration were detected in all samples. 16s rDNA sequencing needs to be improved, such as the extraction of bacterial nucleic acid, the selection of hypervariable region, and the selection of universal primers. The selection of sequencing platform and later data analysis strategy. We tested seven methods to extract bacterial nucleic acid from simulated samples. After sequencing, we analyzed the content and relative distribution of various bacteria in simulated samples, and looked for a broad spectrum and high efficiency method for bacterial nucleic acid extraction. In screening a sample of a patient with an unknown cause of fever, we sequenced the macro genome of the virus, and found that the genome IME-16, of a virus belonging to Microviridae was quite different from previous reports, and we annotated it. Evolution analysis and structural protein analysis suggested that IME-16 might be a branch far away from alphaviruses. When sequencing the virus macro genome of a hepatitis B patient's serum sample, we optimized the analysis method of biological information, accelerated the speed of data analysis, and found some previously reported Anelloviridae virus sequences related to hepatitis. A total of 10 Torque Teno Midi Virus (TTMDV) sequences and 3 Torque Teno Virus (TTV) sequences were found to be quite different from those previously reported. We annotated and analyzed these sequences and confirmed that they belong to a new type of Anelloviridae virus. To sum up, we used macro genome sequencing to screen a batch of samples for unknown causes of foot rot, an unknown cause of fever, and a sample for hepatitis B patients. The whole genome sequences of pathogenic bacteria and new viruses have been found. Meanwhile, we have improved the methods of bacterial genome extraction and data analysis. In a word, with the improvement of the method of macro genome sequencing and the improvement of analysis technology, macrogenomics will make a great contribution to the detection of pathogens.
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R446.5

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