【摘要】：目的 熱休克蛋白GrpE是熱休克蛋白超家族70重要成員之一,被認為是一種負性調(diào)控基因。該基因在肺炎鏈球菌的感染中有相關作用。對肺炎鏈球菌熱休克蛋白GrpE進行克隆表達,純化及熱穩(wěn)定性測定,以便于進一步分析肺炎鏈球菌感染的分子機制。方法設計特異性引物,通過PCR技術擴增目的基因。構(gòu)建pW28-GrpE重組表達質(zhì)粒。在大腸桿菌(Escherichia coli, E.coli) B834中獲得可溶性上清表達。利用Ni2+-NTA親和層析柱、DEAE陰離子交換層析柱、Hiload Superdex 75凝膠層析柱對靶蛋白進行純化。TSA法測定GrpE熱穩(wěn)定性,氣相擴散法獲得蛋白質(zhì)晶體。結(jié)果重組構(gòu)建質(zhì)粒pW28-GrpE可以在表達菌E.coli B834中獲得可溶性上清表達。GrpE蛋白具有較高純度(95%以上),目的蛋白在溶液中以二聚體形式存在。發(fā)現(xiàn)重組GrpE蛋白在20 mM鹽濃度、pH6.0緩沖液中有較高熱穩(wěn)定性。獲得衍射能力為5A的蛋白質(zhì)晶體。結(jié)論 利用蛋白質(zhì)表達純化的經(jīng)典技術,獲得了高表達、高純度的GrpE蛋白。為下一步蛋白質(zhì)晶體的優(yōu)化及相關基礎研究奠定了基礎。
[Abstract]:Objective Heat shock protein (GrpE) is one of the important members of heat shock protein superfamily 70 (HSP70) and is considered to be a negative regulatory gene. This gene plays a related role in the infection of Streptococcus pneumoniae. In order to further analyze the molecular mechanism of Streptococcus pneumoniae infection, the GrpE of Streptococcus pneumoniae was cloned and expressed, purified and determined in thermal stability. Methods specific primers were designed and the target gene was amplified by PCR. The recombinant expression plasmid of pW28-GrpE was constructed. The soluble supernatant was expressed in Escherichia coli (Escherichia coli, E.coli B834. The target protein was purified by Ni2 NTA affinity chromatography column and DEAE anion exchange chromatography column, Hiload Superdex 75 gel chromatography column. The thermal stability of GrpE was determined by TSA method, and protein crystals were obtained by gas phase diffusion. Results the recombinant plasmid pW28-GrpE could be expressed in the soluble supernatant of E.coli B834. The GrpE protein had high purity (more than 95%), and the target protein existed in the form of dimer in solution. It was found that the recombinant GrpE protein had high thermal stability in pH6.0 buffer at 20 mM salt concentration. Protein crystals with diffraction power of 5A were obtained. Conclusion GrpE protein with high expression and high purity was obtained by using the classical technique of protein expression and purification. It lays a foundation for the further optimization of protein crystals and related basic research.
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R440

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