本文選題：短串聯(lián)重復(fù)序列 + 復(fù)合擴(kuò)增�。� 參考：《福建醫(yī)科大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：目的:建立包括D3S1358、D13S317、D7S820、CSF1PO、D16S539、D12S391、D18S51、Amelogenin、D5S818和FGA10個STR基因座的熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增體系,探討該體系用于檢測造血干細(xì)胞移植嵌合體的可行性。方法:選取D3S1358、D13S317、D7S820、CSF1PO、D16S539、D12S391、D18S51、Amelogenin、D5S818和FGA10個STR基因座。D3S1358、D13S317、D7S820、CSFIPO上游引物的5'端用6-FAM標(biāo)記,D16S539、D12S391、D18S51上游引物的5'端用HEX標(biāo)記,Amelogenin、D5S818、FGA上游引物的5'端用TAMRA標(biāo)記。優(yōu)化STR基因座復(fù)合擴(kuò)增體系中的引物濃度、DNA模板濃度、退火溫度、循環(huán)次數(shù)等參數(shù),建立最佳復(fù)合擴(kuò)增體系。運(yùn)用傳統(tǒng)的制備方法,制備10個STR基因座常見基因型的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物。分析本方法與Sinofiler試劑盒所檢測的等位基因的一致性;檢測DNA靈敏度;制備體外模擬嵌合體樣本,分析每組測得的嵌合率平均值與理論嵌合率的差異;進(jìn)行重復(fù)性實驗;比對本方法與Sinofiler試劑盒檢測造血干細(xì)胞移植標(biāo)本嵌合體的相關(guān)性。結(jié)果:建立了10個STR基因座的復(fù)合擴(kuò)增體系:總體積25μL,10′Go Taq Buffer5μL,2.5mmol/L d NTP3μL,10μmol/L的各基因座D3S1358、D13S317、D7S820、CSF1PO、D16S539、D12S391、D18S51、Amelogenin、D5S818、FGA引物分別為0.5μL、0.4μL、0.7μL、0.55μL、0.45μL、0.5μL、0.5μL、0.6μL、0.7μL、0.7μL,Go Taq DNA聚合酶0.3μL、10ng/μL的DNA 3μL,去離子水8.1μL。熱循環(huán)參數(shù):95℃5min;94℃45s,59℃45s,72℃45s,30次循環(huán);60℃55min;15℃∞。用本方法和Sinofiler試劑盒檢測423份樣本等位基因分型結(jié)果完全一致。該體系能檢測最低DNA濃度為0.4 ng/μL。模擬嵌合體樣本,最小檢出的供者嵌合率范圍為2.5%-5%。r=0.998,回歸方程y=0.9835x+0.7829 R2=0.997。批內(nèi)和批間重復(fù)性實驗,結(jié)果顯示標(biāo)準(zhǔn)差均小于2%,批內(nèi)變異系數(shù)為3.75%,批間變異系數(shù)為1.23%-7.97%。用本方法和Sinofiler試劑盒檢測104份造血干細(xì)胞移植后嵌合體樣本,兩方法的r=0.997,線性回歸方程y=1.0108x-0.8418 R2=0.9941。結(jié)論:成功構(gòu)建了D3S1358、D13S317、D7S820、CSF1PO、D16S539、D12S391、D18S51、Amelogenin、D5S818和FGA10個STR基因座復(fù)合擴(kuò)增體系,該體系可應(yīng)用ABI3100檢測平臺,獲得可靠的分型結(jié)果。本復(fù)合擴(kuò)增體系可檢測出造血干細(xì)胞移植嵌合體的供體嵌合率,靈敏度高、特異性強(qiáng),完全能夠滿足臨床需要。同時也為開發(fā)國產(chǎn)STR試劑盒打下了良好的基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective: to establish a fluorescent multiplex amplification system including D3S1358-D13S317D7S820 CSF1POF1POF1D16S539D12S391D18S51Amelogenin D5S818 and FGA10 STR loci, and to explore the feasibility of using the system to detect chimerism in hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). Methods: D3S1358-D13S317D7S820 CSF1POF1POD16S539D12S391D12S391D18S51Amelogenin D5S818 and FGA10 STR loci. D3S1358-D13S317D7S820CSFIPO upstream primer 5'end was labeled with MRTAA at the 5'end of the primer D16S539D12S39S51 upstream using HEX to mark the 5'end of the upstream primer of Amelogenin D5S818FGA. The optimal amplification system was established by optimizing the primer concentration and DNA template concentration, annealing temperature and cycle times of STR locus multiplex amplification system. The allelic alleles of 10 STR loci were prepared by traditional preparation method. To analyze the consistency of alleles detected by this method and the Sinofiler kit, to detect DNA sensitivity, to prepare in vitro simulated chimerism samples, to analyze the differences between the average and theoretical chimerism rates measured in each group, and to carry out repetitive experiments. To compare the correlation between this method and Sinofiler kit for detecting chimerism in hematopoietic stem cell transplantation specimens. 緇撴灉:寤虹珛浜，

本文編號：2066855