本文選題：移植物抗宿主病　切入點：TLR4　出處：《華中科技大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：第一部分MyD88信號過表達與急性G疾病進展的相關(guān)性 [目的]探討TLR4/MyD88/NF-κB信號通路在小鼠異基因骨髓移植后急性移植物抗宿主病(GVHD)中的表達及意義。 [方法]以雄性C57BL/6(H-2Kb)小鼠和雌性BALB/c(H-2Kd)小鼠作為骨髓移植的供受者,術(shù)前受者接受致死劑量(8.0Gy)的全身照射處理,4～6小時內(nèi)輸注供者來源的骨髓細胞(1*107)和不同數(shù)量的脾臟淋巴細胞(1*107,n=12或2*107,n=12)建立不同嚴重程度的小鼠急性GVHD模型,未接受任何處理的正常BALB/c小鼠作為空白對照(n=6)。以GVHD臨床評分,生存期,靶器官病理作為GVHD的評價指標(biāo)；分別采用實時熒光定量PCR,免疫組化和western blot法檢測GVHD模型小鼠小腸組織中TLR4、MyD88和NF-κBp65的表達;并統(tǒng)計其基因表達譜的改變與GVHD進展的相關(guān)性。 [結(jié)果]急性GVHD的病情進展依賴于異基因脾臟淋巴細胞的輸注數(shù)量,隨GVHD的病情惡化,小腸組織中TLR4、MyD88與NF-κBp65的表達均呈上升趨勢。重度GVHD小鼠病變腸組織TLR4, NF-κBp65mRNA水平較正常對照顯著升高(P0.05)。組織中蛋白表達也有相同的趨勢。此外,TLR4、MyD88和NF-κB mRNA間的表達不僅呈正相關(guān),而且其與GVHD的臨床評分也呈正相關(guān)(R=0.814,P0.001；R=0.828,P0.001；R=0.568,P--0.034)。 [結(jié)論]GVHD小鼠靶器官組織中TLR4/MyD88/NF-κB信號通路呈明顯的活化狀態(tài),基因轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯均有增強,且與GVHD病情呈顯著的正相關(guān),可作為藥物研發(fā)的新靶點。 第二部分新型MyD88抑制劑TJ-5緩解急性GVHD及機制 [目的]探討MyD88抑制劑TJ-M2010-5(TJ-5)對在小鼠異基因骨髓移植后急性GVHD的抑制作用及機制,基于天然免疫為GVHD的藥物治療提供新思路。 [方法](1)免疫共沉淀檢測TJ-5對MyD88同源二聚化的影響：流式細胞術(shù)及ELISA檢測TJ-5對DC成熟活化的影響;蛋白質(zhì)印跡檢測TJ-5對DC內(nèi)MyD88信號通路關(guān)鍵分子的表達影響；淋巴細胞混合培養(yǎng)檢測TJ-5對異基因T淋巴細胞增殖的作用。(2)建立C57BL/6(H-2Kb)→BALB/c (H-2K)的小鼠骨髓移植后急性GVHD模型。實驗分為四組：GVHD空白對照組,TJ-5治療組,CD40L單抗(MR1)治療組,聯(lián)合治療組。術(shù)后以GVHD臨床評分,生存期,靶器官病理,炎性因子水平,組織壞死與修復(fù),嵌合體形成及特異性耐受的形成作為藥物療效的評價指標(biāo),比較兩藥單獨用藥的差異及聯(lián)合用藥治療GVHD的效果。 [結(jié)果]TJ-5能夠劑量依賴性的抑制MyD88分子的同源二聚化和LPS刺激引起的DC成熟,減少其上清液中炎性因子IL-la, IL-10,IL-12和IL-18分泌：隨TJ-5劑量增加,DC表面TLR4的表達逐漸升高,而下游分子IRAK4,NF-Bp65的表達卻明顯降低；TJ-5能減少DC/T混培體系中CD4+T和CD8+T淋巴細胞的增殖。移植后觀察60天,TJ-5與MR1組生存期,GVHD臨床評分均顯著優(yōu)于對照組(P0.05)；聯(lián)合用藥效果更佳,60天生存率達100%,明顯高于MR1組(70%),TJ-5組(57%)和對照組(0%);對照組小鼠肝臟,小腸,皮膚組織Thomas GVHD病理分級Ⅲ-Ⅳ級,其余三組靶器官病變較輕,呈Ⅰ～Ⅱ級改變。TJ-5治療可加速異基因嵌合體的形成,明顯改善GVHD小鼠血循環(huán)中炎性因子,減少靶器官細胞凋亡,并促進組織修復(fù)。 [結(jié)論]新型MyD88抑制劑TJ-5可緩解小鼠骨髓移植后GVHD的進展,天然免疫與獲得性免疫系統(tǒng)同時抑制策略可取得更好的抗GVHD效果,具有廣闊的應(yīng)用前景。 第三部分TJ-5對荷骨髓瘤小鼠骨髓移植后GVT的影響 [目的]探討MyD88抑制劑TJ-M2010-5(TJ-5)在抗GVHD的同時能否保留GVT效應(yīng),為TJ-5的臨床應(yīng)用提供進一步實驗依據(jù)。 [方法]建立C57BL/6(H-2Kb)→BALB/c(H-2Kd)的GVHD荷骨髓瘤(SP2/0)小鼠模型。實驗分為三組：骨髓重建對照組,腫瘤復(fù)發(fā)組,單純T細胞組,T細胞與TJ-5共同作用組。小鼠的死亡歸結(jié)為GVHD相關(guān)死亡和腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)死亡進行評價。觀察60天,記錄各組GVHD體重變化,繪制臨床評分和生存曲線。對GVT靶器官脾臟和骨髓進行病理檢測：流式細胞術(shù)檢測TJ-5對骨髓瘤細胞系SP2/0凋亡壞死和細胞周期的影響,對DC表面趨化因子CCR7表達的影響和對受者脾臟內(nèi)Treg的比例的影響,以進一步明確保留GVT效應(yīng)的可能機制。 [結(jié)果]TJ-5治療組與GVT對照組60天存活率分別為50%與12.6%,荷瘤死亡率組間有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.04),TJ-5組GVT靶器官骨髓,脾臟組織病變減輕,腫瘤細胞浸潤減少,與單純GVT對照組相比,并未觀察到削弱的GVT改變。在體外實驗條件下,TJ-5可劑量依賴的促進骨髓瘤SP2/0細胞的的凋亡與壞死,并使SP2/0細胞的增殖生長周期停滯在G1期;TJ-5可抑制LPS導(dǎo)致的DC表面趨化分子CCR7的表達上調(diào);經(jīng)TJ-5治療后的GVHD小鼠脾臟內(nèi)Treg的含量明顯增高,差異據(jù)有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 [結(jié)論]TJ-5治療荷瘤GVHD小鼠過程中對移植物GVT效果并無明顯的抑制作用。TJ-5保留GVT效應(yīng)的機制可能與直接誘導(dǎo)腫瘤細胞死亡,趨化因子CCR7表達下調(diào),受體Treg含量增加有關(guān)。 第四部分單純宿主MyD88基因缺陷無GVHD保護作用 [目的]探討宿主來源MyD88分子在異基因骨髓移植后急性GVHD進展中的作用,為TJ-5臨床應(yīng)用時間窗提供實驗依據(jù)。 [方法]以野生型(wt)或MyD88基因敲除(ko)BALB/c(H-2Kd)小鼠作為受體,C57BL/6(H-2Kb)小鼠為供體,建立小鼠急性GVHD模型。觀察30天,以生存期,體重變化,GVHD I臨床評分,病理,炎性因子水平作為GVHD評價指標(biāo)。激光共聚焦技術(shù)評價供者源性細胞在宿主體內(nèi)的增殖情況,確定細胞類型與效應(yīng)；ELISA檢測受體內(nèi)LPS的水平差異；免疫組化檢測腸上皮細胞的增殖與凋亡；蛋白印跡法檢測腸上皮細胞內(nèi)MyD88依賴性Cox-2信號的表達；實時定量PCR檢測腸上皮緊密連接蛋白(ZO-1, claudin-3和occludin)的表達評價腸屏障功能；淋巴細胞混合培養(yǎng)技術(shù)檢測受體MyD88敲除對異基因淋巴細胞增殖的影響。 [結(jié)果]在相同的預(yù)處理實驗條件下,MyD88-/-小鼠較wt宿主表現(xiàn)出更嚴重的GVHD:生存時間,體重下降,GVHDI臨床評分均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05); MyD88敲除加重肝臟和小腸病理損傷,增加外周循環(huán)中LPS的含量和組織中GVHD相關(guān)炎性分子(TNF-α、IL-4和IL-12)的表達。相對于野生型受體而言,MyD88-/-小鼠脾臟,小腸和肝臟內(nèi)有更多的H-2kb陽性的供者細胞和DC浸潤,腸上皮細胞凋亡增加,增殖減少。MyD88依賴的Cox-2的表達在MyD88-/-小鼠腸上皮細胞中顯著下降(P0.05);腸上皮緊密連接分子ZO-1, claudin-3和occludin在MyD88-/-GVHD小鼠腸道和肝臟中的表達均明顯下降,組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05); MyD88基因缺陷未明顯降低混培體系中的異基因淋巴細胞增殖。 [結(jié)論]宿主MyD88分子在GVHD進展中起到一定的保護作用,機制與減少供者效應(yīng)細胞的浸潤,增加腸上皮屏障的穩(wěn)定性與黏膜保護性分子Cox-2的表達有關(guān)。骨髓移植前給予TJ-5抑制MyD88分子并不能緩解GVHD的進展。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R457.7

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本文編號：1675995