本文關(guān)鍵詞： 磁性納米粒子 表面修飾 磁分離 病毒 核酸提取　出處：《東南大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：病毒是一類嚴(yán)格的細(xì)胞寄生生物,主要由蛋白質(zhì)外殼和核酸組成。有些病毒能夠感染人或植物,并引起嚴(yán)重的人類傳染病或植物病害,從而對人類健康或作物生產(chǎn)產(chǎn)生嚴(yán)重的危害。由于病毒對人類健康和植物生長具有極大威脅。因而,快速、有效和靈敏的檢測技術(shù)對于有效控制病毒傳播的具有十分重要的意義。本論文旨在通過合成不同表面化學(xué)修飾的四氧化三鐵磁性顆粒,并分析磁性顆粒與核酸(DNA和RNA)之間的吸附與解吸附性質(zhì),進(jìn)而建立基于磁性顆粒的病毒核酸提取方法,結(jié)合實時熒光定量PCR技術(shù),實現(xiàn)病毒的靈敏、快速檢測。主要內(nèi)容及工作結(jié)果歸納如下：(1)利用高溫裂解法和熔劑熱法合成粒徑大小分別為10和200 nm左右的四氧化三鐵磁性顆粒。在此基礎(chǔ)上,首先利用四乙氧基硅烷修飾10 nm四氧化三鐵磁性納米顆粒,合成二氧化硅包裹的磁性顆粒(Silica-coated magnetic particles, SMPs),從而改善磁性顆粒在水溶液中的分散性,獲得表面帶有負(fù)電的磁性顆粒；另外,依次利用四乙氧基硅烷和γ-氨丙基三乙氧基硅烷修飾200 nm的四氧化三鐵磁性顆粒,合成氨基硅烷化磁性顆粒(Aminosilane-modified magnetic particles, AMPs);最后,利用羧基苯硼酸對10 nm四氧化三鐵磁性顆粒進(jìn)行功能化修飾,獲得羧基苯硼酸修飾的磁性納米顆粒(Carboxyphenylboronic acid-functionalized magnetic particles, CPBA-MNPs)。磁性顆粒的表征結(jié)果表明,成功合成了上述不同表面化學(xué)修飾的磁性顆粒,其表面基團(tuán)分別為：羥基、氨基和苯硼酸。(2)以鮭魚精DNA和大腸桿菌RNA為材料,分析SMPs與核酸的吸附和解吸附性質(zhì)。結(jié)果表明：在低濃度異硫氰酸胍(1.0 M)溶液中,SMPs對核酸的吸附量最大；Langmuir吸附等溫線擬合分析表明,1 mg SMPs對DNA和RNA的最大吸附量分別為10.6μg和7.6μg；溶液的酸堿性質(zhì)對于吸附量具有較大的影響,在酸性條件下,能夠顯著降低核酸與SMPs間的靜電斥力,從而提高核酸吸附量；乙醇與異丙醇的加入能夠降低吸附體系的極性,從而增加核酸的吸附量。CPBA-MNPs與核酸之間的吸附與解吸附性質(zhì)分析結(jié)果表明：二價陽離子(如Ca2+、Mg2+)以及乙醇的加入能夠顯著提高核酸吸附量；在酸性條件下,RNA的吸附量大于在堿性條件下的吸附量；由于苯硼酸分子與RNA之間形成了可逆的環(huán)酯結(jié)構(gòu),通過加入順式雙醇類似物可有效地將RNA洗脫,Tris-EDTA溶液(50 mM Tris,5 mM EDTA, pH 8.8)的洗脫效率分別為75.6±7.6%(DNA)和60.1±5.9%(RNA)(3)在研究SMPs與核酸吸附與解吸附性質(zhì)的基礎(chǔ)上,以SMPs為吸附材料,分析提取血清中乙肝病毒和丙肝病毒核酸的可行性,以及利用實時熒光PCR/RT-PCR實現(xiàn)對乙肝病毒和丙肝病毒的快速檢測。結(jié)果表明：在蛋白酶K和1.0 M異硫氰酸胍存在的條件下,56℃水浴15 min能夠有效的釋放HBV和HCV的核酸；通過加入1倍體積乙醇,能夠有效的分離提取HBV和HCV的核酸；建立HBV和HCV的實時熒光PCR/RT-PCR檢測方法和定量標(biāo)準(zhǔn)曲線能夠有效的應(yīng)用于HBV和HCV的檢測與定量。利用實時熒光PCR/RT-PCR技術(shù)定量分析SMPs的核酸回收效率分別為30±11.1%(HBV)和34±7.3%(HCV),高于已報道的商業(yè)試劑盒的提取效率。此外,將上述方法應(yīng)用于進(jìn)出北京口岸旅行人員的乙肝與丙肝病毒的檢測與分析,結(jié)果表明,SMPs方法和實時熒光PCR/RT-PCR方法能夠有效地用于出入境人員的病毒核酸提取和分析工作中。(4)以SMPs為固相吸附載體,建立提取植物病毒核酸的方法,并應(yīng)用于植物病毒(南芥菜花葉病毒、百合無癥病毒)及類病毒(啤酒花矮化類病毒、葡萄黃斑類病毒1)的檢測。利用體外轉(zhuǎn)錄合成覆蓋實時熒光RT-PCR擴(kuò)增區(qū)的RNA標(biāo)準(zhǔn)品,構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,標(biāo)準(zhǔn)曲線覆蓋6-7個數(shù)量級,并且最低檢測限為100拷貝／反應(yīng)。為評價SMPs方法的核酸提取效率,將體外轉(zhuǎn)錄合成的RNA標(biāo)準(zhǔn)品加入到植物樣品裂解液中,分別利用SMPs方法、TRIzo1和RNeasy Plant mini kit回收提取。結(jié)果表明,在回收百合葉片樣品中的核酸時,SMPs方法與兩種商業(yè)試劑盒相等,無明顯差異；而當(dāng)回收葡萄葉片中的核酸時,SMPs方法的回收效率高商業(yè)試劑盒2-3倍。利用SMPs方法分別提取15株感染LSV和15株感染ArMV的百合樣品,利用實時熒光RT-PCR進(jìn)行檢測。對于檢測ArMV, SMPs方法與其他方法沒有明顯統(tǒng)計學(xué)上的差異,而對于檢測LSV,結(jié)果略有不同。同TRIzo1相比,SMPs方法具有相同的病毒載量數(shù)量級,而與RNeasy Plant mini kit相比,SMPs方法的平均病毒載量低0.51oglo。利用SMPs方法提取19株葡萄樣本的核酸,采用實時熒光RT-PCR方法進(jìn)行HSVd和GYSVd-1篩查。結(jié)果顯示,無論是HSVd還是GYSVd-1,在陽性率和病毒載量上,SMPs方法均優(yōu)于其他方法(TRIzol和RNeasy Plant mini kit)。因此,SMPs方法能夠有效的提取植物病毒與類病毒核酸,從而實現(xiàn)植物病毒和類病毒的快速檢測。(5)基于CPBA-MNPs與DNA和RNA的吸附與解吸附性質(zhì),建立針對復(fù)雜植物樣本材料的核酸提取方法。CPBA-MNPs提取核酸的可行性分析結(jié)果表明,Tris與EDTA對CPBA-MNPs吸附核酸具有不利影響；在不同的條件下,可分別提取玉米與大豆種子樣品中的基因組DNA,總核酸或RNA,并且具有較高的質(zhì)量。此外,將提取大豆種子(感染菜豆莢斑駁病毒和煙草環(huán)斑病毒)的RNA和轉(zhuǎn)基因玉米的基因組DNA進(jìn)行實時熒光RT-PCR/PCR進(jìn)行檢測,結(jié)果表明利用苯硼酸修飾的磁性納米顆粒提取的核酸適用于實時熒光RT-PCR/PCR檢測。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R440;TB383.1

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