第一章 文獻(xiàn)綜述

1.1 石榴概述

石榴皮是石榴的干燥果皮，研究表明石榴皮具有降血脂、抗病毒、抗氧化、抗腹瀉、抗腫瘤及抗菌等生理活性（熱依木古麗·阿布都拉等 2013）。石榴皮具有豐富的多酚類物質(zhì)，約為石榴皮干重量的 10%～20%，其組分為安石榴苷、沒食子酸、表兒茶素、石榴皮亭 A、石榴皮亭 B、鞣花酸等，其中安石榴苷含量最高（楊筱靜等 2013）。石榴皮占石榴的 20%～30%，除少數(shù)藥用外，絕大部分卻沒有被充分的利用，幾乎被廢棄，造成資源的極大浪費(fèi)。目前，石榴皮的應(yīng)用主要集中在食品、藥品、日化用品和功能高分子材料等方面。

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1.2 安石榴苷概況
1.2.1 結(jié)構(gòu)特性及來源

安石榴苷（2, 3-(S)-hexahydroxydiphenoyl-4, 6-(S, S)-gallagyl-Dglucose）是一種多羥基的酚類化合物，分子式為 C48H27O30，分子量為 1084.72。安石榴苷為棕褐色粉末，易溶于水，乙醇和甲醇等，屬于水解性單寧。安石榴苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖 1-1所示。

安石榴苷主要存在于石榴科植物中，為石榴的主要活性成分之一，分布于石榴的皮、籽和汁中（孟祥樂等 2014）；安石榴苷具有同分異構(gòu)體，分別為 α 型和 β 型（見圖 1-1）。安石榴苷為石榴皮中含量最高的鞣花酸單寧，占石榴皮干果重的 5%-15%（張杰等2014）；受氣候、品種和管理水平等的影響，不同地區(qū)的石榴皮中安石榴苷的含量會(huì)有所差異。
1.2.2 生理活性功能
1.2.2.1 抗氧化作用
安石榴苷具有酚羥基的結(jié)構(gòu)，是石榴皮多酚中起關(guān)鍵抗氧化作用的成分。體外研究表明，安石榴苷具有較強(qiáng)的清除超氧陰離子自由基（O2-）、ABTS·自由基、DPPH·自由基以及 H2O2的能力；另外，安石榴苷對(duì)脂質(zhì)的過氧化具有一定的抑制作用（Aqil et al.2012；Seeram et al. 2005；Kulkarni et al. 2004；梁俊等 2012）。
1.2.2.2 抗病毒作用
安石榴苷對(duì)單純皰疹 1 型病毒、巨細(xì)胞病毒、丙型肝炎病毒、革登病毒、麻疹病毒和呼吸道合胞病毒等具有抑制作用，其機(jī)理主要是干擾病毒與細(xì)胞表面的氨基多糖（GAGs）的相互作用（Lin et al. 2013）。另外，Yang et al.（2012）通過小鼠實(shí)驗(yàn)證明安石榴苷能降低腸病毒 71 引起的細(xì)胞病變，降低小鼠的死亡率并減輕腸病毒感染小鼠的臨床癥狀。
1.2.2.3 抗菌作用
研究表明，安石榴苷具有抑制多種食源性致病菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和弧菌）的能力，其最小抑菌濃度（MIC）范圍為 45 μg/ml~3 200 μg/ml（Taguri etal. 2004）。其次，安石榴苷對(duì)真菌（Alternaria alternata, Penicillium digitatum, Penicilliumexpansum 等）也具有較強(qiáng)的抑制作用（Glazer et al. 2012）。另外，Li et al.（2014）表明富含安石榴苷的石榴皮提取物對(duì)單核增生李斯特菌具有抑制作用，其機(jī)理為富含安石榴苷的石榴皮提取物破壞單核增生李斯特菌細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，使胞內(nèi)的紫外物質(zhì)、鉀離子和ATP 釋放到胞外，細(xì)胞膜電勢(shì)和胞內(nèi)外 pH 值差也發(fā)生改變；另外，李斯特菌的菌體形態(tài)也發(fā)生了變化。
1.2.2.4 護(hù)肝作用
Lin et al.（1998，2001）研究表明安石榴苷對(duì)四氯化碳或乙酰氨基酚誘導(dǎo)的小鼠肝損傷具有治療作用；安石榴苷能夠降低肝損傷小鼠血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶的含量，并能減輕四氯化碳或乙酰氨基酚對(duì)小鼠所造成的肝中央靜脈病理病變以及氧化損傷。
1.2.2.5 抗炎作用
在炎癥反應(yīng)的過程中，安石榴苷能夠抑制巨噬細(xì)胞 RAW264.7 合成 NO，并能夠減少白介素（IL）-6，IL-1β，腫瘤壞死因子（TNF）-α 和前列腺素 E2（PGE2）的分泌；同時(shí)，通過抑制 IκBα 和 p65 的磷酸化而抑制 MAPK 和 NF-κB 通路的激活（Xu et al.2014）。另外，安石榴苷能抑制 CD4+T 細(xì)胞合成 IL-2，并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明安石榴苷能夠抑制丙二醇甲醚醋酸酯誘導(dǎo)的小鼠耳部慢性水腫或者角叉菜膠誘導(dǎo)的鼠急性足爪腫脹（Lee et al. 2008；Lin et al. 1999）。
第二章 石榴皮中抑菌活性物質(zhì)的篩選

石榴（punica granatum L.）為石榴科、石榴屬植物，是傳統(tǒng)的藥食兩用植物之一，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值；研究表明，石榴具有澀腸止瀉、抗氧化、抗病毒、抗癌等功能（Jurenka 2008；Miguel et al. 2010）。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)石榴皮抑菌活性的研究主要集中在石榴皮粗提物抑菌方面，而石榴皮中起抑菌作用的主要成分還未見報(bào)道（Malviya et al. 2014；Finegold et al. 2014；董周永等 2008a 和 2008b）。因此，本章以食品中常見的致病菌為供試菌，研究石榴皮中主要的成分對(duì)致病菌的抑制效果，確定石榴皮中起主要抑菌作用的活性成分，為石榴皮的開發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)。

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2.1 材料與方法

2.1.1 材料
蛋白胨緩沖液（BPW）、四硫磺酸鹽煌綠增菌液（TTB）、氯化鎂孔雀綠肉湯增菌液（RV）、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂培養(yǎng)基（XLD）、Luria-Bertan（LB）瓊脂培養(yǎng)基和Luria-Bertani（LB）肉湯培養(yǎng)基等：北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；XLT4培養(yǎng)基：美國(guó)DIFCO 公司。鼠傷寒沙門氏菌 SL 1344：由程相朝教授（河南科技大學(xué)）惠贈(zèng)；單核增生李斯特菌 CMCC 54004：購(gòu)于中國(guó)醫(yī)用菌種保藏中心；金黃色葡萄球菌 ATCC 25923、大腸桿菌 ATCC 25922 和沙門氏菌 LT2：由崔生輝（中國(guó)藥品生物制品檢定所）博士惠贈(zèng)；食物源沙門氏菌：共 9 株，分別于 2007-2012 年，分離自廣西、北京、河南和陜西等地零售雞肉樣品。
2011 年 10 月，嶧城軟籽石榴購(gòu)于陜西省西安市臨潼區(qū)。果實(shí)于當(dāng)天采摘并運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室；剔除裂果和病害果后，用自來水洗凈，手工取皮，并置于恒溫干燥箱（50 ℃）內(nèi)；果皮烘干后，用小型粉碎儀粉碎果皮，粉末過 60 目篩并置于密封袋中，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?br /> 2.1.2 方法
2.1.2.1 石榴皮提取物的制備
提取溶劑為丙酮（濃度為 60%），料液比為 1：10，用超聲波進(jìn)行輔助提取（40 ℃，100 W，10 min），用真空泵進(jìn)行抽濾，分別得到濾渣和濾液；相同的提取條件下，對(duì)濾渣進(jìn)行二次提取，合并提取液；用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮（50 ℃），得到濃縮液并于 4 ℃保存?zhèn)溆谩?br /> 2.1.2.2 石榴皮提取物的純化
（1）Amberlite XAD-16 預(yù)處理 參照朱靜等（2010）所報(bào)道的方法，步驟如下：①用無水乙醇浸泡大孔吸附樹脂（XAD-16）24 h，并用去離子水洗至無醇味；②用 3%HCl 浸泡大孔吸附樹脂（XAD-16）3 h，并用去離子水洗至中性；③用 3% NaOH 浸泡大孔吸附樹脂（XAD-16）3 h，并用去離子水洗至中性；④用 3% HCl 浸泡大孔吸附樹脂（XAD-16）3 h，并用去離子水洗至中性；⑤將大孔吸附樹脂（XAD-16）浸泡于無水乙醇中或直接使用。
（2）單寧的純化 取一定量大孔吸附樹脂（XAD-16），用濕法進(jìn)行裝柱（柱長(zhǎng)徑比為 6:1），裝柱的過程中保證無氣泡產(chǎn)生；取一定體積的提取物濃縮液進(jìn)行上樣（上樣量為 200 ml 濃縮液/500 g 樹脂）；最后進(jìn)行洗脫，步驟大致如下：

首先，用水（約 4 L）進(jìn)行洗脫以除去多余的糖，直至流出液體為澄清；其次，用約 800 ml 的甲醇（100%）洗脫，收集洗脫液，并于 50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)；最后，將濃縮液進(jìn)行真空冷凍干燥，得到粉末狀的純化物。

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2.2 結(jié)果與分析
2.2.1 石榴皮粗提物及純化物的成分及含量
由圖 2-1A 可知，在 2.1.2.3 所設(shè)定的條件下，混合標(biāo)樣中含有的標(biāo)準(zhǔn)品（沒食子酸、安石榴苷 α 和 β 及鞣花酸）得到良好的分離；其中，峰 1 為沒食子酸，峰 2 和 3 為安石榴苷 α 和 β，峰 4 為鞣花酸，安石榴苷 α 和安石榴苷 β 為同分異構(gòu)體。
利用上述已確定的色譜條件對(duì)石榴皮粗提物和純化物中多酚的含量進(jìn)行測(cè)定，并根據(jù)混合標(biāo)樣中峰的保留時(shí)間，按照標(biāo)品所對(duì)應(yīng)的標(biāo)樣方程，確定粗提物和純化物中多酚的種類和含量。由結(jié)果可知，石榴皮粗提物中沒食子酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（下同）為 0.1%，安石榴苷（含 α 和 β 同分異構(gòu)體）為 12.3%，鞣花酸為 0.7%；大孔吸附樹脂（AmberliteXAD-16）純化后，樣品中安石榴苷為 64.2%，鞣花酸為 2.1%，未檢出沒食子酸；說明，石榴皮純化物以單寧類物質(zhì)為主。
2.2.2 沙門氏菌的耐藥性
根據(jù) CLSI（2012）的方法，我們對(duì)從食品中分離得到的 9 株沙門氏菌進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，結(jié)果見表 2-2�？芍瑥氖称分兴@得的 9 株沙門氏菌對(duì) 15 種抗生素表現(xiàn)出不同的耐藥性，展現(xiàn)出不同的耐藥譜。
2.2.3 安石榴苷的成分及含量
試驗(yàn)所使用的安石榴苷標(biāo)品（由成都曼思特生物科技有限公司提供，從石榴皮中提取）的成份及含量如圖 2-2 所示。可知，標(biāo)品中安石榴苷 α 的含量為 39.63%，安石榴苷β 的含量為 58.50%，安石榴苷的總含量為 98.13%。
2.2.4 石榴皮中抑菌活性物質(zhì)的篩選
以金黃色葡萄球菌 ATCC 25923、沙門氏菌 SL 1344 和李斯特菌 CMCC 54004 為受試菌，探究石榴皮粗提物、石榴皮純化物及石榴皮中主要的活性物質(zhì)（安石榴苷、鞣花酸和沒食子酸）對(duì)這 3 種致病菌的抑制作用，結(jié)果見表 2-3。
可知，石榴皮粗提物、石榴皮純化物和石榴皮中主要的活性物質(zhì)（安石榴苷、鞣花酸和沒食子酸）對(duì)這 3 種常見的食源性致病菌具有一定的抑菌作用；這 5 種物質(zhì)對(duì)受試菌的抑菌效果為：安石榴苷>沒食子酸>石榴皮純化物>石榴皮粗提物>鞣花酸；對(duì)于安石榴苷，其對(duì)致病菌的抑菌效果為：金黃色葡萄球菌>沙門氏菌>李斯特菌。石榴皮中主要的活性物質(zhì)為安石榴苷、鞣花酸和沒食子酸，安石榴苷的含量遠(yuǎn)高于鞣花酸和沒食子酸，因此可以推測(cè)安石榴苷是石榴皮中起主要抑菌作用的活性成分。
2.2.5 安石榴苷對(duì)食源性致病菌的最小抑菌濃度

安石榴苷對(duì)沙門氏菌（不同來源、不同耐藥性和不同血清型）、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和單核增生李斯特菌的 MIC 見表 2-4。可知，安石榴苷對(duì)不同來源、耐藥性及血清型的沙門氏菌具有不同程度的抑制作用，其 MIC 為 250-1000 μg/ml，安石榴苷對(duì)SL1344 的 MIC 為 500 μg/ml。另外，安石榴苷對(duì)金黃色葡萄球菌、李斯特菌和大腸桿菌的 MIC 分別為 250 μg/ml，，2500 μg/ml 和 10000 μg/ml；金黃色葡萄球菌對(duì)安石榴苷最敏感，其次為沙門氏菌、李斯特菌，而大腸桿菌對(duì)安石榴苷的敏感性較差。

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第三章 安石榴苷對(duì)沙門氏菌細(xì)胞膜的影響...........................32
3.1 材料與方法............................................... 32
3.1.1 材料..................................................... 32
3.1.2 方法..................................................... 33
第四章 安石榴苷對(duì)沙門氏菌運(yùn)動(dòng)性及相關(guān)基因的影響...............41
4.1 材料與方法................................................. 41
4.1.1 材料........................................................ 41
第五章 安石榴苷對(duì)沙門氏菌群體效應(yīng)的影響........................55
5.1 材料與方法................................................. 55

5.1.1 材料...................................................... 55

第八章 安石榴苷體內(nèi)抗沙門氏菌感染的作用研究

石榴皮中含有多種活性物質(zhì)，包括單寧類、黃酮類、生物堿及萜類等（Viuda-Martoset al. 2010）。石榴皮在許多國(guó)家的傳統(tǒng)醫(yī)藥中被廣泛的用于治療多種感染類疾病，如痢疾、腹瀉、寄生蟲感染以及呼吸系統(tǒng)感染等。目前，體外研究證實(shí)石榴皮提取物具有抑制多種食源性致病菌以及病毒的作用，如大腸桿菌、沙門氏菌、李斯特菌和金黃色葡萄球菌等，且抑菌作用主要?dú)w功于其所含的單寧類物質(zhì)（董周永 2008；Machado et al. 2003；Reddy et al. 2007）。Choi et al.（2011）通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)石榴皮粗提物能夠顯著減少沙門氏菌感染小鼠的病理癥狀和降低沙門氏菌感染小鼠的死亡率。雖然石榴皮長(zhǎng)期以來被廣泛使用，但是對(duì)其中抗感染的主要成分和其抗感染的機(jī)理尚不明確。因此，本章以石榴皮單寧的主要成分安石榴苷為材料，通過動(dòng)物模型探討安石榴苷抗沙門氏菌感染的具體功效。

8.1 材料與儀器
8.1.1 主要試劑
安石榴苷（純度 ≥ 98%）：成都曼思特生物科技有限公司；酶聯(lián)免疫試劑盒（ELISA；IFN-γ，TNF-α，IL-6 和 IL-10）：上海鑫樂生物科技有限公司；木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）培養(yǎng)基，大豆酪蛋白瓊脂（TSA）培養(yǎng)基，LB 瓊脂培養(yǎng)基，LB 肉湯培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；NaCl，KCl，Na2HPO4·12H2O，K2HPO4，甲醛（純度 37%-40%）（分析純）：四川西隴化工有限公司；BCA 蛋白定量分析試劑盒和 RNA 提取試劑盒（Code No. CW0560）：北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Code No.RR037A）：寶生物工程（大連）有限公司；SYBR 試劑盒（Code No. DRR820S）：寶生物工程（大連）有限公司；小鼠飼料：西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；抗凝血真空采血管和促凝血真空采血管：河北鑫樂科技有限公司；氨芐青霉素（分析純）：美國(guó)AMERSO 公司；質(zhì)粒提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；其它試劑：均為分析純。
8.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
SPF 級(jí)健康雄性 C57BL6 小鼠 60 只，體重 18 - 22 g，購(gòu)于西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)合格證號(hào) SCXK（陜）2012-003。
8.1.4 主要試劑配制
（1）生理鹽水（0.9% NaCl）：準(zhǔn)確稱取 NaCl 9.0 g，并溶于去離子水中，定容至1000 ml，高壓滅菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?br /> （2）磷酸緩沖液（PBS）：同 6.1.1.5。
（3）安石榴苷溶液：準(zhǔn)確稱量安石榴苷 5 mg 和 2.5 mg，分別溶于 10 ml 0.9% NaCl溶液中，過濾后 4 ℃保存?zhèn)溆谩?br /> （4）LB 肉湯：稱取 25.0 g 于 1 L 蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，121 ℃高壓滅菌 15 min，冷卻后 4 ℃保存?zhèn)溆谩?br /> （5）LB 瓊脂：稱取 40.0 g 于 1 L 蒸餾水中，混勻并完全溶解，121 ℃高壓滅菌 15min，冷卻至 45 ℃左右，搖勻，傾注平板。
（6）XLD：稱取 58.9 g 于 1 L 蒸餾水中，加熱煮沸滅菌，冷卻至 55 ℃左右，搖勻，傾注平板。
（7）TSA：稱取 30.0 g 于 1 L 蒸餾水中，混勻并完全溶解，121 ℃高壓滅菌 15 min，冷卻至 45 ℃左右，加 100 μl 氨芐青霉素至終濃度為 10 μg/ml，搖勻，傾注平板。

（8）10%甘油：取甘油 1 ml 加入 9 ml 蒸餾水中，混勻，121 ℃高壓滅菌，冷卻后4 ℃保存?zhèn)溆谩?

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第九章 結(jié)論、創(chuàng)新點(diǎn)與展望

9.1 結(jié)論
本研究以安石榴苷為材料，通過 RT-PCR、ELISA、電鏡以及細(xì)胞培養(yǎng)等技術(shù)手段從直接抑菌、影響毒力基因的表達(dá)、干擾細(xì)菌群體感應(yīng)、抗粘附和侵入上皮細(xì)胞能力、免疫調(diào)節(jié)能力等角度對(duì)安石榴苷抗沙門氏菌感染的可能的多重機(jī)制進(jìn)行探討，同時(shí)通過小鼠灌胃感染實(shí)驗(yàn)研究了安石榴苷抗沙門氏菌感染的具體效應(yīng)。本研究將為從石榴皮中開發(fā)能用于預(yù)防及控制沙門氏菌疾病的物質(zhì)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究所取得的結(jié)果如下：
（1）安石榴苷是石榴皮中起主要抑菌功能的活性成分，其抑菌效果優(yōu)于鞣花酸和沒食子酸；安石榴苷對(duì)金黃色葡萄球菌 ATCC25923、沙門氏菌 SL1344、李斯特菌CMCC54004 和大腸桿菌 ATCC25922 等致病菌的最小抑菌濃度（MIC）分別為 250、500、2500 和 10000 μg/ml；另外，安石榴苷對(duì)不同食品來源（不同的耐藥性及血清型）的沙門氏菌具有抑制作用，其 MIC 為 250 – 1000 μg/ml。
（2）安石榴苷破壞沙門氏菌細(xì)胞膜的完整性。經(jīng)安石榴苷作用后，沙門氏菌胞內(nèi)物質(zhì)（K+）釋放到胞外，細(xì)胞膜出現(xiàn)去極化現(xiàn)象，細(xì)胞內(nèi)的 pH 值顯著升高，胞內(nèi)外 pH值差發(fā)生改變，說明安石榴苷使沙門氏菌的細(xì)胞膜通透性發(fā)生變化；由掃描電鏡的結(jié)果知，安石榴苷對(duì)沙門氏菌菌體有損傷作用，使菌體細(xì)胞表面破損，內(nèi)容物溶出，導(dǎo)致菌體細(xì)胞死亡。
（3）安石榴苷影響沙門氏菌的運(yùn)動(dòng)性及相關(guān)基因的表達(dá)。在對(duì)沙門氏菌生長(zhǎng)曲線無影響的濃度下，安石榴苷（31.250 μg/ml 和 15.125 μg/ml）抑制沙門氏菌的泳動(dòng)能力和群集運(yùn)動(dòng)；但是，安石榴苷對(duì)沙門氏菌的蹭動(dòng)能力無明顯影響；RT-PCR 結(jié)果表明，安石榴苷（濃度為 31.250 μg/ml 和 15.125 μg/ml）能夠使沙門氏菌鞭毛基因（fliA，fliY，fljB，flhC 等）的表達(dá)量降低；同時(shí)，安石榴苷能夠影響沙門氏菌與在體內(nèi)定植有關(guān)的基因（如fimD、sopB、invH、sipA、pipB、orf245、hflK、lrp、xthA、sodC 和 rpoS）的轉(zhuǎn)錄水平；另外，安石榴苷抑制 SPI-1 和 SPI-2 III 型分泌系統(tǒng)的調(diào)控因子 hilA 和 ssrB 的表達(dá)，進(jìn)而顯著影響沙門氏菌的毒性和致病能力。
（4）安石榴苷影響沙門氏菌的群體效應(yīng)系統(tǒng)。濃度為 31.250 μg/ml 的安石榴苷對(duì)紫色桿菌的生長(zhǎng)具有一定的抑制作用；在不影響紫色桿菌生長(zhǎng)的情況下，安石榴苷（濃度為 15.125 μg/ml 和 7.563 μg/ml）能夠抑制紫色桿菌分泌紫色素，進(jìn)而影響群體效應(yīng)系統(tǒng)。由 RT-PCR 的結(jié)果知，安石榴苷（濃度為 31.250 μg/ml 和 15.125 μg/ml）能夠抑制沙門氏菌群體效應(yīng)基因 sdiA 和 srgE 的表達(dá)，進(jìn)而干擾沙門氏菌的群體效應(yīng)。另外，進(jìn)一步的研究表明，在體內(nèi)，安石榴苷可能通過其代謝產(chǎn)物尿石素 A 來發(fā)揮抗沙門氏菌群體效應(yīng)的作用。

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參考文獻(xiàn)（略）

本文編號(hào)：34826