本文關(guān)鍵詞：Cry1A類蛋白交換結(jié)構(gòu)域?qū)⑾x活性影響的研究

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【摘要】：蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是一種廣泛分布的革蘭氏陽性細菌,在形成芽胞的同時能產(chǎn)生由cry或cyt基因編碼的殺蟲晶體蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,ICPs),對多種害蟲有特異殺蟲活性。目前,Bt不僅被開發(fā)成生物農(nóng)藥在害蟲防治中得到應用,表達Bt Cry蛋白的轉(zhuǎn)基因抗蟲植物也已經(jīng)被廣泛種植,帶來了巨大的經(jīng)濟效益與生態(tài)效益。其中Cry1A是一個對鱗翅目害蟲有高活性的殺蟲蛋白家族,目前已知的Cry1A類基因有10個模式種類,112個殺蟲基因。這些基因中cry1Ab、cry1Ac應用最為廣泛,cry1Ah基因是中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所克隆的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的殺蟲基因,其編碼的Cry1Ah蛋白對棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)、亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis)和水稻二化螟(Chilo suppressalis)等多種鱗翅目害蟲具有很高的毒殺活性,超過目前商業(yè)化的cry1Ab、cry1Ac等基因,具有巨大的應用前景,目前正在進行轉(zhuǎn)基因抗蟲植物研究。對目前已經(jīng)明確殺蟲活性蛋白的各結(jié)構(gòu)域進行序列比對聚類發(fā)現(xiàn),部分殺蟲活性(特別是Cry1類蛋白)可以由結(jié)構(gòu)域III的重組獲得,Cry毒素結(jié)構(gòu)域交換是一種殺蟲特異性進化的機制。通過序列比對發(fā)現(xiàn),Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ah三個蛋白之間有共同的結(jié)構(gòu)域II;Cry1Ab、Cry1Ac有共同的結(jié)構(gòu)域I;而Cry1Ac、Cry1Ah有共同的結(jié)構(gòu)域III。Cry1Ab結(jié)構(gòu)域III與Cry1Ac、Cry1Ah不同,但是在Cry1A家族中比較常見,與Cry1Aa、Cry1Ae、Cry1Af等蛋白結(jié)構(gòu)域III序列一致性大于97%;Cry1Ah結(jié)構(gòu)域I比較獨特,不僅與Cry1Ab、Cry1Ac不同,與所有報道的Bt殺蟲蛋白的結(jié)構(gòu)域I差異都較大。本研究通過同源建模的方法比較了Cry1Ab,Cry1Ah結(jié)構(gòu)域I結(jié)構(gòu)、表面電荷分布特點;進一步構(gòu)建了編碼cry1Ah與cry1Ab、cry1Ca雜合基因;并對部分雜合基因進行了表達與功能研究,取得結(jié)果如下。利用SWISS-MODEL建模分別獲得了Cry1Ah1與Cry1Ab13結(jié)構(gòu)域I以及三個結(jié)構(gòu)域核心活性區(qū)的機構(gòu)信息,通過分子疊合比對發(fā)現(xiàn),盡管Cry1Ah1與Cry1Ab13序列存在較大差異(31%),但是兩者結(jié)構(gòu)域I的碳骨架沒有差異。進一步分析了結(jié)構(gòu)域I的表面結(jié)構(gòu)與表面靜電勢分布,結(jié)果顯示盡管兩個蛋白結(jié)構(gòu)域I的碳骨架沒有差異,由于氨基酸序列以及氨基酸側(cè)鏈基團不同,兩個蛋白的結(jié)構(gòu)表面以及電勢分布都有所不同。通無縫克隆方法,構(gòu)建了4種雜合基因;AhAhCa含有Cry1Ah結(jié)構(gòu)域I、II和Cry1Ca結(jié)構(gòu)域III;p ET-AHAHAB含有Cry1Ah結(jié)構(gòu)域I、II和Cry1Ab結(jié)構(gòu)域III;AhAbAb含有Cry1Ah結(jié)構(gòu)域I和Cry1Ab結(jié)構(gòu)域II、III;PET-AHCACA含有Cry1Ah結(jié)構(gòu)域I和Cry1Ca結(jié)構(gòu)域II、III。成功表達了Cry1Ab、Cry1Ah的雜合蛋白p ET-AHAHAB并測定了殺蟲活性,結(jié)果顯示結(jié)構(gòu)域交換引起蛋白殺蟲譜的顯著變化。這些數(shù)據(jù)表明,3D-Cry蛋白殺蟲特異性可能不僅和結(jié)構(gòu)域II、結(jié)構(gòu)域III有關(guān),還有可能與包括結(jié)構(gòu)域I在內(nèi)的三個結(jié)構(gòu)域的組合有關(guān)。3D-Cry蛋白中3個結(jié)構(gòu)域兩兩之間都有接觸,包括結(jié)構(gòu)域I在內(nèi)的不同的結(jié)構(gòu)域組合都會影響蛋白結(jié)構(gòu)表面微環(huán)境的變化,這些變化可能會對Cry蛋白的性質(zhì)產(chǎn)生影響。進一步分析雜合蛋白殺蟲特異性變化的原因?qū)M一步揭示3D-Cry蛋白殺蟲特異性進化機制有重要意義。
【關(guān)鍵詞】：蘇云金芽胞桿菌 結(jié)構(gòu)與功能 pET-AHAHCA pET-AHAHAB
【學位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S482.39
【目錄】：

• 摘要9-11
• 英文摘要11-13
• 1 前言13-28
• 1.1 蘇云金芽胞桿菌13
• 1.2 蘇云金芽胞桿菌殺蟲蛋白13-23
• 1.2.1 Cry蛋白13-14
• 1.2.2 Cry蛋白命名14-15
• 1.2.3 Cry蛋白作用機制15
• 1.2.4 Cry蛋白結(jié)構(gòu)15-21
• 1.2.5 Cry蛋白的進化21-23
• 1.3 Cry1Ah蛋白23-24
• 1.4 Cry1Ab蛋白24-25
• 1.5 Cry1Ca蛋白25-27
• 1.6 本研究的目的與意義27
• 1.7 立題依據(jù)27-28
• 2 材料與方法28-36
• 2.1 材料28-31
• 2.1.1 供試菌株和質(zhì)粒28
• 2.1.2 引物合成及序列測定28-29
• 2.1.3 抗生素29
• 2.1.4 培養(yǎng)基29
• 2.1.5 核酸電泳試劑29
• 2.1.6 E.coli質(zhì)粒DNA提取29-30
• 2.1.7 生化試劑和酶30
• 2.1.8 標準分子量30
• 2.1.9 SDS - PAGE試劑30
• 2.1.10其他試劑30-31
• 2.2 儀器設(shè)備31
• 2.3 供試昆蟲31
• 2.4 試驗方法31-34
• 2.4.1 大腸桿菌質(zhì)粒提取31-32
• 2.4.2 PCR擴增程序32
• 2.4.3 重疊PCR擴增32
• 2.4.4 轉(zhuǎn)化32-33
• 2.4.5 基因鑒定33
• 2.4.6 序列的測定及分析33
• 2.4.7 雜合蛋白表達33-34
• 2.5 蛋白電泳檢測34
• 2.6 殺蟲活性測定34-36
• 2.6.1 小菜蛾生物活性測定34-35
• 2.6.2 玉米螟生物活性測定35
• 2.6.3 甜菜夜蛾、棉鈴蟲的生物活性測定35
• 2.6.4.猿葉甲生物活性測定35-36
• 3 結(jié)果與分析36-55
• 3.1 pET-AHAHAB構(gòu)建36-42
• 3.1.1 Cry1Ah與Cry1Ab、pET-AHAHAB序列比較36
• 3.1.2 Cry1Ah與Cry1Ab結(jié)構(gòu)域I比較36-37
• 3.1.3 Cry1Ah與Cry1Ab雜合蛋白構(gòu)建37-38
• 3.1.4 pET-AHAHAB蛋白定量結(jié)果38-39
• 3.1.5 pET-AHAHAB生物活性測定39-42
• 3.2 AhAhCa構(gòu)建42-47
• 3.2.1 Cry1Ah1與Cry1Ca7、AhAhCa序列比較42-43
• 3.2.2 Cry1Ah與Cry1Ca結(jié)構(gòu)域I比較43-44
• 3.2.3 Cry1Ah與Cry1Ca雜合蛋白構(gòu)建44
• 3.2.4 構(gòu)建雜合蛋白測序結(jié)果44-45
• 3.2.5 AhAhCa蛋白定量結(jié)果45
• 3.2.6 AhAhCa生物活性測定45-47
• 3.3 AhAb Ab構(gòu)建47-50
• 3.3.1 Cry1Ah與Cry1Ab、AhAbAb序列比較47
• 3.3.2 Cry1Ah與Cry1Ab雜合蛋白構(gòu)建47-48
• 3.3.3 cry1Ah和cry1Ab13 PCR擴增產(chǎn)物48
• 3.3.4 AhAbAb酶切鑒定結(jié)果48
• 3.3.5 AhAbAb轉(zhuǎn)Rosetta PCR鑒定結(jié)果48-49
• 3.3.6 AhAbAb蛋白表達49
• 3.3.7 p ET-AHABAB 生物活性測定49-50
• 3.4 pET-AHCACA構(gòu)建50-55
• 3.4.1 Cry1Ah與Cry1Ca、pET-AHCACA序列比較50-51
• 3.4.2 cry1Ah和cry1Ca7 PCR擴增產(chǎn)物51
• 3.4.3 p ET-AHCACA酶切鑒定結(jié)果51-52
• 3.4.4 pET-AHCACA轉(zhuǎn)Rosetta PCR鑒定結(jié)果52
• 3.4.5 pET-AHCACA表達52-53
• 3.4.6 pET-AHCACA生物活性測定53-55
• 4 討論55-57
• 5 結(jié)論57-58
• 致謝58-60
• 參考文獻60-66
• 附錄66-67
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術(shù)論文67

【參考文獻】

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 代平禮;轉(zhuǎn)Bt cry1Ah基因玉米對蜜蜂的安全性研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2011年

2 岳同卿;轉(zhuǎn)Bt Cry1 Ah基因抗蟲玉米的研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2009年

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本文編號：664439