發(fā)布時(shí)間：2017-07-14 02:18

  本文關(guān)鍵詞：保加利亞乳桿菌ATCC 11842酸耐受機(jī)制關(guān)鍵基因的表達(dá)分析

  更多相關(guān)文章： 保加利亞乳桿菌 后酸化 轉(zhuǎn)錄組學(xué) 半定量RT-PCR 丙糖異構(gòu)酶基因

【摘要】：酸奶中的乳酸菌能將大分子蛋白質(zhì)分解成人體易吸收的小分子營養(yǎng)物質(zhì),這對(duì)人體具有很重要保健功能,但酸奶嚴(yán)重的后酸化問題不僅嚴(yán)重影響風(fēng)味,還大大縮短了酸奶的貨架期,阻礙了我國酸奶行業(yè)發(fā)展。經(jīng)無數(shù)學(xué)者的研究證明控制保加利亞乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)在發(fā)酵后期的生長代謝是解決酸奶嚴(yán)重后酸化關(guān)鍵。乳酸菌需要克服生產(chǎn)、貯藏、運(yùn)輸過程中發(fā)酵介質(zhì)的酸性環(huán)境,還要克服人體胃腸道的酸性環(huán)境(pH2.5-3.5)才可以到達(dá)小腸發(fā)揮益生作用[2-3]。保加利亞乳桿菌的耐酸能力在發(fā)酵酸奶、酸奶后酸化和發(fā)揮胃腸道益生功能中扮演著重要角色。保加利亞乳桿菌屬于嗜酸乳桿菌菌群,其在世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用于酸奶等發(fā)酵乳品生產(chǎn),成為最具經(jīng)濟(jì)價(jià)值的同型發(fā)酵乳酸菌之一。Adolfsson O.和Shihata A.的研究中證明該菌種具有維持人體胃腸道菌群生態(tài)平衡、抑制腸道內(nèi)病原菌滋長、和提高機(jī)體免疫力的益生功能。盡管對(duì)其進(jìn)行了大量研究,但大多集中在其發(fā)酵性能和應(yīng)用方面的研究,但是對(duì)此菌的代謝機(jī)制等方面研究甚少。本研究通過研究模式菌株保加利亞乳桿菌ATCC 11842菌株在脫脂乳復(fù)原培養(yǎng)基中的基本生長特性和產(chǎn)酸特性,選取總RNA提取的時(shí)間,提取總RNA后進(jìn)行半定量RT-PCR試驗(yàn),其中以16S rDNA基因作為內(nèi)參基因,對(duì)參與保加利亞乳桿菌ATCC11842菌株酸耐受機(jī)制的一些相關(guān)基因在不同生長時(shí)期的表達(dá)情況進(jìn)行檢測；根據(jù)半定量RT-PCR的結(jié)果,選取出在表達(dá)量上存在差異比較明顯的基因進(jìn)行進(jìn)一步深入研究,以期能夠探究出差異基因在酸奶后酸化過程中的相關(guān)機(jī)理。研究結(jié)果表明(1)模式菌株保加利亞乳桿菌ATCC 11842菌株在脫脂乳中發(fā)酵11h到達(dá)發(fā)酵終點(diǎn),發(fā)酵終點(diǎn)pH至為4.8、活菌數(shù)為2.3×108 CFU/mL;發(fā)酵結(jié)束后立即將發(fā)酵脫脂乳放到4℃貯藏,7d后測得pH值為4.6、活菌數(shù)1.5×108 CFU/mL。(2)選取4個(gè)不同時(shí)期提取總RNA,分別是發(fā)酵對(duì)數(shù)中后期(pH 5.3)、發(fā)酵終點(diǎn)(pH 4.8)、完成發(fā)酵后于4℃C冰箱降溫2 h、4℃貯藏7d(pH 4.6)。通過電泳檢測、紫外分光光度計(jì)檢測和RT-PCR檢測總RNA提取質(zhì)量,確定質(zhì)量合格。進(jìn)行半定量RT-PCR試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)tpiA基因在在不同發(fā)酵時(shí)期的表達(dá)差異比較明顯,在后酸化期表達(dá)量明顯高于其他三個(gè)時(shí)期。(3)本研究針對(duì)這一基因進(jìn)行深入研究：構(gòu)建重組載體V1和V2,V1是由正向的tpiA基因和質(zhì)粒pMG36e重組構(gòu)成,V2是由反向的tpiA基因和質(zhì)粒pMG36e重組構(gòu)成。將質(zhì)粒pMG36e和V1成功的轉(zhuǎn)化到保加利亞乳桿菌ATCC 11842中,結(jié)果表明該基因過表達(dá)與對(duì)照菌株相比其pH變化一致,但是菌株在穩(wěn)定期的OD值稍有下降,由此證明過量表達(dá)該基因?qū)υ摼戤a(chǎn)酸沒有太大影響。本研究為深入研究保加利亞乳桿菌的酸耐受機(jī)制調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供更多有價(jià)值的信息,為開發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的弱后酸化能力的酸奶發(fā)酵劑提供理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：保加利亞乳桿菌 后酸化 轉(zhuǎn)錄組學(xué) 半定量RT-PCR 丙糖異構(gòu)酶基因
【學(xué)位授予單位】：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：TS252.1
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 1 引言10-19
• 1.1 乳酸菌過度產(chǎn)酸對(duì)酸奶品質(zhì)的影響10-12
• 1.1.1 通過添加外來物控制菌的生長和產(chǎn)酸能力11
• 1.1.2 在酸奶發(fā)酵劑中調(diào)整保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的比例11-12
• 1.1.3 生物技術(shù)育種12
• 1.2 乳酸菌耐酸受機(jī)制的研究進(jìn)展12-15
• 1.2.1 乳酸菌酸耐受機(jī)制的研究進(jìn)展13-14
• 1.2.2 保加利亞乳桿菌酸耐受機(jī)制的研究進(jìn)展14-15
• 1.3 基于高通量測序技術(shù)的乳酸菌酸耐受機(jī)制解析15-17
• 1.3.1 基因組學(xué)15
• 1.3.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)15-16
• 1.3.3 半定量RT-PCR技術(shù)16-17
• 1.4 提升乳酸菌酸脅迫抗性的策略研究17-18
• 1.4.1 代謝途徑策略提升乳酸菌酸脅迫抗性17
• 1.4.2 基于乳酸菌應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制提升乳酸菌酸脅迫抗性17-18
• 1.5 本文研究的內(nèi)容和意義18-19
• 2 材料19-25
• 2.1 菌株和質(zhì)粒19
• 2.2 培養(yǎng)基19
• 2.3 試劑19-20
• 2.3.1 主要生化試劑19-20
• 2.3.2 主要分子生物學(xué)試劑20
• 2.4 主要儀器設(shè)備20-21
• 2.5 試驗(yàn)試劑及緩沖液的配制21-23
• 2.5.1 基因組提取試劑21
• 2.5.2 大腸桿菌感受態(tài)制備相關(guān)試劑的配制21
• 2.5.3 大腸桿菌質(zhì)粒提取試劑21
• 2.5.4 保加利亞乳桿菌ATCC 11842原生質(zhì)體制備試劑21-22
• 2.5.5 乳酸菌質(zhì)粒提取試劑22
• 2.5.6 其它試劑的配制22-23
• 2.6 引物設(shè)計(jì)23-25
• 3 試驗(yàn)方法25-41
• 3.1 真空冷凍干燥的保加利亞乳桿菌ATCC 11842菌株的復(fù)蘇培養(yǎng)及分子鑒定25-27
• 3.1.1 菌株的復(fù)蘇培養(yǎng)25
• 3.1.2 菌株的分子鑒定25-27
• 3.2 保加利亞乳桿菌ATCC 11842菌株在MRS和RSM復(fù)原脫脂乳培養(yǎng)基中的生長特性及產(chǎn)酸特性的研究27-28
• 3.2.1 保加利亞乳桿菌ATCC 11842菌株在MRS培養(yǎng)基中的生長曲線27-28
• 3.2.2 保加利亞乳桿菌ATCC 11842菌株在RSM復(fù)原脫脂乳培養(yǎng)基中的生長曲線及產(chǎn)酸特性28
• 3.3 保加利亞乳桿菌ATCC 11842菌株在RSM復(fù)原脫脂乳中發(fā)酵不同時(shí)期總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄28-31
• 3.3.1 不同發(fā)酵時(shí)期保加利亞乳桿菌ATCC 11842菌株總RNA的提取28-30
• 3.3.2 提取總RNA的質(zhì)量檢測30
• 3.3.3 反轉(zhuǎn)錄30-31
• 3.4 半定量RT-PCR31-33
• 3.5 tpiA基因的克隆及功能分析33-41
• 3.5.1 tpiA基因的PCR克隆33-35
• 3.5.2 DNA的回收純化及測序35
• 3.5.3 大腸桿菌DH5a中提取質(zhì)粒pMG36e及單酶切鑒定35-36
• 3.5.4 tpiA基因的超量表達(dá)載體和反義載體的構(gòu)建36-37
• 3.5.5 重組載體電擊轉(zhuǎn)化電轉(zhuǎn)化大腸桿菌37-39
• 3.5.6 質(zhì)粒pMG36e和重組載體V1電擊轉(zhuǎn)化電轉(zhuǎn)化保加利亞乳桿菌ATCC 1184239-40
• 3.5.7 后酸化關(guān)鍵基因的功能分析40-41
• 4 結(jié)果與分析41-56
• 4.1 保加利亞乳桿菌ATCC 11842菌株在光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)和菌落形態(tài)41-42
• 4.2 保加利亞乳桿菌ATCC 11842菌株在MRS液體培養(yǎng)基中的生長曲線和產(chǎn)酸特性42-43
• 4.3 保加利亞乳桿菌ATCC 11842菌株在RSM復(fù)原脫脂乳培養(yǎng)基中的生長特性和產(chǎn)酸特性43-46
• 4.4 4個(gè)不同發(fā)酵時(shí)期的總RNA的提取及定量分析46-49
• 4.4.1 不同的細(xì)胞裂解方案對(duì)總RNA提取的影響46-47
• 4.4.2 不同的醇沉條件對(duì)總RNA提取的影響47-49
• 4.5 半定量RT-PCR檢測基因轉(zhuǎn)錄水平差異49-50
• 4.6 tpiA基因的克隆及功能分析50-56
• 4.6.1 tpiA基因的PCR擴(kuò)增50-51
• 4.6.2 質(zhì)粒pMG36e提取及驗(yàn)證結(jié)果51-52
• 4.6.3 重組載體的構(gòu)建52-54
• 4.6.4 tpiA基因的功能分析54-56
• 5 討論56-59
• 5.1 酸奶后酸化問題56
• 5.2 脫脂乳中乳酸菌總RNA的提取56-57
• 5.3 tpiA基因的簡介及作用機(jī)理57-59
• 6 結(jié)論59-60
• 參考文獻(xiàn)60-65
• 附錄65-68
• 在校期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文68-69
• 作者簡介69-70
• 致謝70

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 崔艷華;曲曉軍;馬鶯;;雙組分系統(tǒng)分析預(yù)測共生機(jī)制[J];哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2010年11期

2 付瑞燕;李寅;;利用代謝工程技術(shù)提高工業(yè)微生物對(duì)脅迫的抗性[J];生物工程學(xué)報(bào);2010年09期

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本文編號(hào)：539303