本文關(guān)鍵詞：不同地區(qū)蘇云金芽胞桿菌vip3Aa基因的鑒定及殺蟲活性分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：全球農(nóng)業(yè)的健康發(fā)展一直受到農(nóng)業(yè)害蟲的制約,農(nóng)業(yè)害蟲的防控和治理,多年來主要依靠化學(xué)農(nóng)藥�；瘜W(xué)農(nóng)藥大劑量、大范圍的施用對生態(tài)系統(tǒng)造成非常嚴(yán)重的破壞,對全球農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展構(gòu)成威脅。采用生防的手段可以有效的解決這些難題,蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt)殺蟲活性高,而且對人、畜等非靶生物無害,現(xiàn)已成為使用最為普遍的環(huán)境友好型殺蟲微生物。然而,長期施用Bt制劑使部分敏感的農(nóng)業(yè)害蟲產(chǎn)生了抗性,目前應(yīng)用的Bt菌株存在殺蟲譜窄和毒力低等缺點,因此我們要篩選新型高毒力的Bt基因來滿足生防的需求,擴(kuò)大Bt的殺蟲譜,豐富轉(zhuǎn)基因資源。本研究首次比較了中國不同氣候類型(熱帶-海南省,亞熱帶-廣西省,溫帶-黑龍江省)的Bt菌株和vip基因的分布情況。從海南841份土樣中分離出156株Bt菌(18.55%),從廣西1420份土樣中分離出356株Bt菌(25.07%),從黑龍江1010份土樣中分離出167株Bt菌(16.53%);從海南的156株Bt菌鑒定出22個vip3基因(14.10%),廣西的356株Bt菌鑒定出2個vip3基因(5.62%),黑龍江的156株Bt菌沒有鑒定出vip3基因(0%)。本實驗利用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment Length Polymorphism,PCR-RFLP)方法成功從海南的SL3和SL4 Bt菌株分別鑒定、克隆出vip3Aa的全長基因,并獲得登錄號KP309808和KT792883,經(jīng)Bt國際命名委員會正式命名為vip3Aa57和vip3Aa62。將這兩個基因插入到表達(dá)載體pET-21b,轉(zhuǎn)化菌株Rosetta(DE3),在低溫條件下均表達(dá)88 k Da大小的蛋白。將蛋白進(jìn)行生物活性測定,結(jié)果顯示Vip3Aa57蛋白對甜菜蛾(Spodoptera exigua)有體重抑制的作用,對棉鈴蟲(Heliothis armigera)無明顯的生物活性;Vip3Aa62蛋白對甜菜蛾具有較好的殺蟲活性,LC50為5.124 ng/mg;對棉鈴蟲活性較低,LC50為870.1 ng/mg。石蠟切片結(jié)果顯示Vip3Aa57蛋白使甜菜蛾中腸細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生變化。通過這些研究結(jié)果表明Bt菌株和vip基因的分布有地域性差異,在溫度較高的熱帶、亞熱帶地區(qū)有比較豐富的Bt菌株和vip基因資源。本研究將有利于充分利用土壤中的Bt菌株,分離具有自主知識產(chǎn)權(quán)和重要應(yīng)用價值的新型vip抗蟲基因,這將會為研究新型殺蟲蛋白,延緩害蟲抗性問題提供有利幫助。
【關(guān)鍵詞】：蘇云金芽胞桿菌 vip基因 鑒定 氣候類型 生物活性測定
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S476
【目錄】：

• 摘要8-9
• 英文摘要9-11
• 1 前言11-26
• 1.1 蘇云金芽胞桿菌11-12
• 1.2 蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白12-15
• 1.2.1 殺蟲晶體蛋白的類型12
• 1.2.2 殺蟲晶體蛋白的作用機(jī)理12-14
• 1.2.3 殺蟲晶體蛋白的應(yīng)用14-15
• 1.3 營養(yǎng)期殺蟲蛋白15-22
• 1.3.1 營養(yǎng)期殺蟲蛋白的分類15-17
• 1.3.2 營養(yǎng)期殺蟲蛋白的作用機(jī)理17-22
• 1.3.3 營養(yǎng)期殺蟲蛋白的應(yīng)用前景22
• 1.4 殺蟲蛋白的鑒定方法22-24
• 1.4.1 PCR-RFLP鑒定22
• 1.4.2 分子雜交鑒定22-23
• 1.4.3 蛋白鑒定23
• 1.4.4 HRM檢測方法23-24
• 1.4.5 PCR-HTS檢測方法24
• 1.5 重要農(nóng)業(yè)害蟲24-25
• 1.5.1 甜菜蛾24
• 1.5.2 棉鈴蟲24-25
• 1.6 本研究的立題依據(jù)和目的意義25-26
• 2 材料與方法26-40
• 2.1 實驗材料26-32
• 2.1.1 菌株與質(zhì)粒26
• 2.1.2 化學(xué)試劑及酶試劑26-27
• 2.1.3 培養(yǎng)基27
• 2.1.4 抗生素27
• 2.1.5 常見溶液和緩沖液27-31
• 2.1.6 供試?yán)ハx31
• 2.1.7 儀器設(shè)備31-32
• 2.1.8 標(biāo)準(zhǔn)分子量32
• 2.2 實驗方法32-40
• 2.2.1 菌株的分離32-33
• 2.2.2 晶體形態(tài)觀察33
• 2.2.3 Bt基因組的提取33
• 2.2.4 引物設(shè)計33
• 2.2.5 PCR擴(kuò)增33-34
• 2.2.6 酶切反應(yīng)34-35
• 2.2.7 瓊脂糖凝膠電泳檢測35
• 2.2.8 DNA膠回收35
• 2.2.9 重組反應(yīng)35
• 2.2.10 E.coli感受態(tài)細(xì)胞制備35-36
• 2.2.11 熱擊轉(zhuǎn)化36
• 2.2.12 大腸桿菌質(zhì)粒的提取36
• 2.2.13 vip3Aa基因在E.coli中誘導(dǎo)表達(dá)36-37
• 2.2.14 Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白親和層析蛋白質(zhì)37
• 2.2.15 SDS-PAGE電泳37
• 2.2.16 蛋白定量的方法37-38
• 2.2.17 殺蟲活性測定及數(shù)據(jù)處理38
• 2.2.18 石蠟切片38-40
• 3 結(jié)果與分析40-49
• 3.1 Bt菌株的分離鑒定40-41
• 3.2 vip3類基因的鑒定41-43
• 3.2.1 vip3基因的鑒定41-42
• 3.2.2 vip3Aa基因的鑒定42-43
• 3.3 vip3Aa類基因的克隆表達(dá)及序列分析43-44
• 3.4 Vip3Aa蛋白的純化44-45
• 3.5 室內(nèi)殺蟲活性測定45-47
• 3.5.1 初篩45-46
• 3.5.2 復(fù)篩46-47
• 3.6 石蠟切片47-49
• 4 討論49-51
• 5 結(jié)論51-52
• 致謝52-53
• 附錄53-54
• 參考文獻(xiàn)54-60
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文60

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 李玉紅;李海濤;高繼國;趙世源;張春鴿;趙燦;;蘇云金芽胞桿菌cry2Ab、cry9Ea基因的表達(dá)及活性分析[J];生物技術(shù)通報;2012年10期

2 李怡萍;梁革梅;仵均祥;陳豪;馬康生;吳孔明;郭予元;;蘇云金芽孢桿菌殺蟲機(jī)理及害蟲對其抗性機(jī)制的研究進(jìn)展[J];西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2010年09期

3 鄧立新;生物農(nóng)藥蘇云金芽孢桿菌殺蟲劑及其增效劑[J];化學(xué)教學(xué);2004年03期

  本文關(guān)鍵詞：不同地區(qū)蘇云金芽胞桿菌vip3Aa基因的鑒定及殺蟲活性分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：480161