【摘要】：短裸甲藻毒素-2（BTX-2）是一種從短裸甲藻中分離出來的聚醚類脂溶性貝類毒素，屬于海洋神經(jīng)性貝類毒素（NSP），主要來源于赤潮爆發(fā)中的有毒藻類，，這些有毒藻源通過食物鏈使毒素在貝類等水產(chǎn)品中蓄積，人誤食了被短裸甲藻毒素污染的貝類、蟹類等水產(chǎn)品之后，會引起惡心嘔吐、呼吸性窘迫、共濟失調(diào)、局部肢體麻痹、口齒不清等癥狀，其原因主要是由于NSP引起了細胞內(nèi)去極化作用。近年來，環(huán)境污染嚴重導(dǎo)致有害赤潮頻繁發(fā)生，由于誤食被NSP污染的貝類而導(dǎo)致食物中毒的事件時有報道。這不僅給水產(chǎn)養(yǎng)殖和加工造成巨大的經(jīng)濟損失，還給人類的身體健康帶來了嚴重的威脅。為了保證公眾遠離毒素隱患和保障水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，加強對BTX-2的檢測和監(jiān)管工作成為解決這一問題的有效途徑。目前，用于BTX-2檢測的方法主要有小鼠生物法、高效液相色譜法、受體結(jié)合分析法、放射免疫分析法等。這些方法都存在各自的優(yōu)缺點，其不足之處是需要專業(yè)人員操作、昂貴的儀器設(shè)備、靈敏度低、涉及動物福利等。為解決上述問題，尋求一種可以快速準確方便檢測BTX-2的方法具有重要意義。在快速免疫學(xué)檢測方法中可選擇的檢測探針除了常用的抗體外，還有被稱之為“化學(xué)抗體”的適配子。為了獲得BTX特異、靈敏的檢測探針，開發(fā)快速免疫學(xué)檢測方法，本研究利用SELEX技術(shù)，篩選BTX-2特異性結(jié)合的高親和力適配子，并以此作為檢測探針，建立ELISA檢測方法。采用混合酸酐法合成BTX-2與卵清白蛋白（OVA）和牛血清白蛋白（BSA）偶聯(lián)物，作為篩選的靶標。設(shè)計并合成總長為85個核苷酸的單鏈隨機寡核苷酸文庫，其中序列兩端分別為含有22個和23個核苷酸的固定序列用于設(shè)計合成引物，中間為含有40個堿基的隨機序列，其中一條引物進行生物素標記，用于次級文庫的擴增和親和力測定。將靶標固定在微孔板中，利用SELEX技術(shù)進行核酸適配子的篩選，PCR進行文庫擴增，瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳進行驗證，經(jīng)過12輪的反復(fù)篩選和富集過程，得到與BTX-2具有高親和力的富集文庫，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、克隆、測序，利用DNAMAN和RNAstructure對所得序列進行一級結(jié)構(gòu)的同源性分析和二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測分析。獲得候選序列，通過間接ELISA進行親和力和特異性檢測，以篩選獲得的適配子B5建立間接競爭ELISA方法，并對條件進行優(yōu)化，獲得標準曲線線性回歸方程為y=-33.219x+80.994，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9875，線性檢測范圍為1.07-68.57ng/mL，最低檢測限為0.835ng/mL。以適配子為檢測探針的競爭ELISA方法的建立為開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的海產(chǎn)品BTX的快速檢測提供備選方法，為開發(fā)快速檢測試劑盒提供實驗基礎(chǔ)，BTX快速檢測方法的研究對保障海產(chǎn)品食用安全具有重要的意義。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：S917.3

【參考文獻】

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1 彭磊;張欣;孟煥新;;人重組S100A8蛋白適配體的篩選和結(jié)構(gòu)分析[J];北京大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2012年01期

2 徐敦明;吳敏;鄒遠;張強;吳崔晨;周昱;劉賢進;;核酸適體技術(shù)在食品安全分析中的應(yīng)用[J];分析化學(xué);2011年06期

3 唐吉軍;謝劍煒;邵寧生;郭磊;閆妍;;采用毛細管電泳技術(shù)篩選特異識別蓖麻毒素適配子的研究[J];高等學(xué)�；瘜W(xué)學(xué)報;2006年10期

4 陳棟;黃慶;黃君富;府偉靈;;適配子及其臨床診斷的應(yīng)用進展[J];國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志;2011年04期

5 李青選;王雪雯;;短裸甲藻毒素的研究進展[J];國外醫(yī)藥(植物藥分冊);1991年01期

6 吳崔晨;胡佳;鄒遠;王馳;劉杰;楊朝勇;;核酸適體在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用[J];化學(xué)進展;2010年08期

7 陳愛亮;陳剛;于洪俠;邱靜;趙燕;楊曙明;;適配體制備技術(shù)及其在農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)污染物檢測中的應(yīng)用[J];農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全;2012年04期

8 蘭小鵬;;適配體技術(shù)及其在醫(yī)學(xué)檢驗研究中的作用[J];臨床檢驗雜志;2012年10期

9 文曉棠;李華;鄧樂;;適配體傳感器在微生物檢測中的應(yīng)用[J];生命科學(xué)研究;2011年05期

10 方曉明,唐毅鋒,劉俊平;高效液相色譜/四極桿-飛行時間質(zhì)譜測定神經(jīng)性貝毒[J];色譜;2004年01期

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1 吳紅兵;Ras蛋白ssDNA適配子的篩選與鑒定[D];武漢大學(xué);2011年

2 胡盼;石房蛤毒素及其抗體適配子的制備與檢測方法的建立[D];吉林大學(xué);2013年

本文編號：2568347