【摘要】：短裸甲藻毒素-2（BTX-2）是一種從短裸甲藻中分離出來(lái)的聚醚類(lèi)脂溶性貝類(lèi)毒素，屬于海洋神經(jīng)性貝類(lèi)毒素（NSP），主要來(lái)源于赤潮爆發(fā)中的有毒藻類(lèi)，，這些有毒藻源通過(guò)食物鏈?zhǔn)苟舅卦谪愵?lèi)等水產(chǎn)品中蓄積，人誤食了被短裸甲藻毒素污染的貝類(lèi)、蟹類(lèi)等水產(chǎn)品之后，會(huì)引起惡心嘔吐、呼吸性窘迫、共濟(jì)失調(diào)、局部肢體麻痹、口齒不清等癥狀，其原因主要是由于NSP引起了細(xì)胞內(nèi)去極化作用。近年來(lái)，環(huán)境污染嚴(yán)重導(dǎo)致有害赤潮頻繁發(fā)生，由于誤食被NSP污染的貝類(lèi)而導(dǎo)致食物中毒的事件時(shí)有報(bào)道。這不僅給水產(chǎn)養(yǎng)殖和加工造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，還給人類(lèi)的身體健康帶來(lái)了嚴(yán)重的威脅。為了保證公眾遠(yuǎn)離毒素隱患和保障水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，加強(qiáng)對(duì)BTX-2的檢測(cè)和監(jiān)管工作成為解決這一問(wèn)題的有效途徑。目前，用于BTX-2檢測(cè)的方法主要有小鼠生物法、高效液相色譜法、受體結(jié)合分析法、放射免疫分析法等。這些方法都存在各自的優(yōu)缺點(diǎn)，其不足之處是需要專(zhuān)業(yè)人員操作、昂貴的儀器設(shè)備、靈敏度低、涉及動(dòng)物福利等。為解決上述問(wèn)題，尋求一種可以快速準(zhǔn)確方便檢測(cè)BTX-2的方法具有重要意義。在快速免疫學(xué)檢測(cè)方法中可選擇的檢測(cè)探針除了常用的抗體外，還有被稱(chēng)之為“化學(xué)抗體”的適配子。為了獲得BTX特異、靈敏的檢測(cè)探針，開(kāi)發(fā)快速免疫學(xué)檢測(cè)方法，本研究利用SELEX技術(shù)，篩選BTX-2特異性結(jié)合的高親和力適配子，并以此作為檢測(cè)探針，建立ELISA檢測(cè)方法。采用混合酸酐法合成BTX-2與卵清白蛋白（OVA）和牛血清白蛋白（BSA）偶聯(lián)物，作為篩選的靶標(biāo)。設(shè)計(jì)并合成總長(zhǎng)為85個(gè)核苷酸的單鏈隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)，其中序列兩端分別為含有22個(gè)和23個(gè)核苷酸的固定序列用于設(shè)計(jì)合成引物，中間為含有40個(gè)堿基的隨機(jī)序列，其中一條引物進(jìn)行生物素標(biāo)記，用于次級(jí)文庫(kù)的擴(kuò)增和親和力測(cè)定。將靶標(biāo)固定在微孔板中，利用SELEX技術(shù)進(jìn)行核酸適配子的篩選，PCR進(jìn)行文庫(kù)擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證，經(jīng)過(guò)12輪的反復(fù)篩選和富集過(guò)程，得到與BTX-2具有高親和力的富集文庫(kù)，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、克隆、測(cè)序，利用DNAMAN和RNAstructure對(duì)所得序列進(jìn)行一級(jí)結(jié)構(gòu)的同源性分析和二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)分析。獲得候選序列，通過(guò)間接ELISA進(jìn)行親和力和特異性檢測(cè)，以篩選獲得的適配子B5建立間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，并對(duì)條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性回歸方程為y=-33.219x+80.994，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9875，線(xiàn)性檢測(cè)范圍為1.07-68.57ng/mL，最低檢測(cè)限為0.835ng/mL。以適配子為檢測(cè)探針的競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的建立為開(kāi)發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的海產(chǎn)品BTX的快速檢測(cè)提供備選方法，為開(kāi)發(fā)快速檢測(cè)試劑盒提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，BTX快速檢測(cè)方法的研究對(duì)保障海產(chǎn)品食用安全具有重要的意義。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：S917.3

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2568347