【摘要】：蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis， Bt），革蘭氏陽性細(xì)菌，在芽胞形成期可產(chǎn)生具有殺蟲活性的伴胞晶體。Bt晶體主要由cry基因編碼的殺蟲晶體蛋白組成，在害蟲的防治中具有重要作用，有巨大的商業(yè)價(jià)值，因此發(fā)掘新基因并進(jìn)行知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)是Bt資源研究的重要內(nèi)容。知識(shí)產(chǎn)權(quán)作為綜合競(jìng)爭(zhēng)力的重要體現(xiàn)，而目前我國(guó)在Bt殺蟲基因資源的知識(shí)產(chǎn)權(quán)方面處于劣勢(shì)，大部分Bt殺蟲基因的專利權(quán)掌握在西方各大型農(nóng)業(yè)生物技術(shù)企業(yè)手中，我國(guó)掌握的Bt新的基因發(fā)明專利不足60項(xiàng)。高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展為發(fā)掘殺蟲基因提供了新思路，成為國(guó)內(nèi)外發(fā)掘Bt殺蟲基因的主要手段。但是測(cè)序價(jià)格較高，Bt資源庫中存在的冗余菌株會(huì)造成較大的資金浪費(fèi)，目前尚沒有便捷的方法去除重復(fù)菌株。因此，迫切需要建立可以快速分析比較大量樣品的方法，來排除重復(fù)菌株，進(jìn)一步提高殺蟲基因發(fā)掘效率。本論文在分離1500株Bt菌株的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步建立了菌株多樣性分析方法，對(duì)菌株多樣性進(jìn)行研究，去除冗余菌株，對(duì)其中90株菌株進(jìn)行了殺蟲基因測(cè)序篩選，主要結(jié)果如下： Bt菌株分離與鑒定：殺蟲活性評(píng)估結(jié)果顯示多數(shù)菌株對(duì)鱗翅目害蟲有較高活性，1500株測(cè)試菌株中，對(duì)棉鈴蟲有活性的菌株有1346株，對(duì)玉米螟有活性菌株有813株，而對(duì)葉甲類害蟲大猿葉甲有活性的菌株較少，只有42株；鏡檢結(jié)果顯示不同菌株產(chǎn)生的晶體形狀、大小、種類有較大差異，晶體種類主要為菱形，部分為球形和不規(guī)則的晶體形狀；殺蟲晶體蛋白圖譜顯示大部分菌株表達(dá)了130kD蛋白，部分菌株還表達(dá)了100Kd、60kD蛋白，具有典型Bt殺蟲晶體蛋白的特征；質(zhì)粒圖譜顯示不同菌株質(zhì)粒圖譜條帶數(shù)量和大小都有所不同，并且有部分菌株圖譜相似，說明資源庫中有冗余菌株。 建立Bt菌株多樣性分析方法：首先，設(shè)計(jì)了可以擴(kuò)增多個(gè)基因家族的兼并引物，fastPCR軟件分析結(jié)果顯示該引物可以對(duì)超過30種的殺蟲基因家族進(jìn)行較好的擴(kuò)增，PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示，該引物可以擴(kuò)增出預(yù)期條帶但是條帶較弱。進(jìn)一步通過增加側(cè)翼特異序列的辦法對(duì)兼并引物進(jìn)行改良，改良后的引物顯著提高了擴(kuò)增效率。同時(shí)，還對(duì)引物濃度與退火溫度進(jìn)行了優(yōu)化，利用72個(gè)不同血清型的標(biāo)準(zhǔn)菌對(duì)優(yōu)化后的PCR體系進(jìn)行了評(píng)估，結(jié)果顯示95%以上的菌株都可以獲得預(yù)期條帶；利用含有多個(gè)基因的HD12菌株評(píng)估了優(yōu)化后體系對(duì)多個(gè)基因同時(shí)擴(kuò)增的能力，結(jié)果顯示優(yōu)化后的PCR可以從HD12獲得9種不同的RFLP類型。這些結(jié)果說明優(yōu)化后的PCR體系具備了cry基因指紋圖譜的基本要求。此外，本論文還對(duì)Bt基因組提取方法進(jìn)行了改良，改良后的方法可以提取并獲得質(zhì)量均一的基因組DNA。用改良的PCR體系對(duì)Bt基因組進(jìn)行擴(kuò)增，并用HinfI對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行消化，利用LabChip GX電泳系統(tǒng)進(jìn)行分析，獲得了888個(gè)菌株的RFLP圖譜。進(jìn)一步對(duì)電泳圖譜進(jìn)行數(shù)字化、計(jì)算相似性、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹分析。結(jié)果顯示，該方法可以有效分析菌株多樣性，去除冗余菌株，獲得可用于進(jìn)一步基因發(fā)掘的菌株。 90株Bt菌株殺蟲基因測(cè)序篩選：利用高通量測(cè)序技術(shù)分析了90株不同的Bt菌株的序列，進(jìn)一步通過SOAPdenovo軟件拼接、GeneMark基因預(yù)測(cè)、模式殺蟲基因數(shù)據(jù)庫及專利數(shù)據(jù)庫blast比對(duì)，最終獲得全新殺蟲基因21個(gè)。 總之，本論文建立菌株多樣性研究方法，解決了冗余菌株會(huì)造成資金的浪費(fèi)的問題，最終完成了“菌株分離去除冗余基因測(cè)序篩選”這一殺蟲基因高通量發(fā)掘平臺(tái)的構(gòu)建，為提升我國(guó)在Bt資源發(fā)掘中的競(jìng)爭(zhēng)力提供了重要保障。
【圖文】：

引 言胞桿菌及其多樣性胞桿菌菌（Bacillus thuringiensis，簡(jiǎn)稱 Bt），芽胞桿菌屬革蘭氏陽劃分為許多不同的亞種，到 2005 年 1 月，鑒定的蘇云金芽胞[ 1]，即使在同一個(gè)血清型或亞種中，不同菌株的特性也會(huì)有準(zhǔn)菌株可以從美國(guó)俄亥俄州立大學(xué)的芽胞桿菌遺傳資源ter，www.bgsc.org)獲得。Bt 在病死昆蟲、土壤、儲(chǔ)藏物、塵的分布，而作為微生物大本營(yíng)的土壤，是 Bt 菌株的主要來源

圖 1-2 Bt 用鄰接法建立的 Bt 鞭毛蛋白氨基酸序列進(jìn)化樹Fig.1-2 Neighbor-joining tree generated from Bt flagellin amino acid sequences們首先分析了蘇云金芽胞桿菌抗原蛋白(H antigen [Hag])序列多樣性[ 8]，并進(jìn)一步行了比較。結(jié)果顯示該蛋白C端111個(gè)氨基酸與N端66個(gè)氨基酸是保守的，稱為C序列聚類結(jié)果分析顯示，多數(shù)情況下不同血清型的蘇云金芽胞桿菌的抗原蛋白也同血清型的菌株的蛋白通常聚集在一起，但是也有部分菌株抗原蛋白與血清型聚小組進(jìn)一步分析了鞭毛蛋白基因 fliC，結(jié)果顯示，盡管大部分不同血清型的菌株 F同，，但是聚類分析結(jié)果顯示鞭毛蛋白基因序列與菌株血清型沒有相關(guān)性[ 7]。對(duì)來的 23 個(gè)亞型的 39 個(gè)菌株進(jìn)行的血清型亞型（serovars）與抗原蛋白基因之間相關(guān)性些基因在數(shù)量上和序列上都有一定的多樣性，并且在一些特定亞型上發(fā)現(xiàn)了亞型特列。與對(duì)菌株進(jìn)行不同血清做免疫反應(yīng)相比 PCR 分析比較相關(guān)編碼基因序列更為析蘇云金芽胞桿菌鞭毛抗原蛋白基因序列在其血清型分類研究上具有較好的應(yīng)用
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：S476.1

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 楊靜妮;蘇云金芽胞桿菌芽胞期母細(xì)胞裂解機(jī)制的研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 熊靜;利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究蘇云金桿菌晶體蛋白Cry6Aa2對(duì)線蟲的作用[D];湖南師范大學(xué);2014年

2 張巧鈴;Bt生物被膜產(chǎn)生菌的篩選與鑒定[D];福建農(nóng)林大學(xué);2014年

本文編號(hào)：2566908