【摘要】：目前，心腦血管疾病的發(fā)病率和死亡率均呈持續(xù)上升趨勢(shì)。我國(guó)每年死于心腦血管病的患者人數(shù)高達(dá)350萬(wàn)。其中，由動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)導(dǎo)致的心腦血管疾病占有重要的位置。AS以血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、脂類堆積、炎癥反應(yīng)、動(dòng)脈壁瘢痕重建和血栓形成等為其主要病理學(xué)特征。血脂異常、糖尿病、高血壓、肥胖、抽煙、代謝綜合征等均與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。 研究表明，AS病理過(guò)程是在眾多危險(xiǎn)因素作用下血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生損傷，繼而發(fā)生的一系列炎癥反應(yīng)，血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷是AS發(fā)生的始動(dòng)因素和中心環(huán)節(jié)。目前臨床上僅有如肝素等少數(shù)特異性靶向于內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用的AS防治藥物，因此，尋找靶向于血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用的AS防治藥物具有重要意義。此外，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、功能障礙時(shí)還會(huì)導(dǎo)致血小板活化，通過(guò)多種機(jī)制參與AS的進(jìn)展，因此抗血小板治療在抗動(dòng)脈粥樣硬化治療中起著重要作用，研究表明氯吡格雷、普拉格雷除了明確的抗血栓作用外，也具有一定的抗炎、減緩AS進(jìn)展的作用。軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院楊日芳副研究員在前期工作的基礎(chǔ)上，采用雙靶標(biāo)藥物設(shè)計(jì)思路、以抗血小板聚集藥物噻吩并吡啶類化合物的功能基團(tuán)四氫噻吩并吡啶取代具有內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用的α-氨基芐基膦酸酯類化合物胺基部分，設(shè)計(jì)合成了新型噻吩并吡啶類化合物，以期獲得具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的兼具抗血小板聚集及內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用的雙靶標(biāo)藥物，改善AS時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，抑制炎癥反應(yīng)，減緩AS的進(jìn)展，并可通過(guò)抑制血栓形成，達(dá)到對(duì)AS及其并發(fā)癥的預(yù)防、治療作用。同時(shí)也期望通過(guò)對(duì)結(jié)構(gòu)的改造，降低噻吩并吡啶類化合物及α-氨基芐基膦酸酯類化合物的副作用并改善其體內(nèi)代謝過(guò)程。 因此，本文工作的主要研究?jī)?nèi)容是篩選并獲得兼具抗血小板聚集及內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用的化合物，并對(duì)其體內(nèi)代謝過(guò)程和作用機(jī)制進(jìn)行初步研究。 第一部分新型噻吩并吡啶類化合物抗血小板聚集作用篩選及體內(nèi)代謝的初步研究 目的：篩選出具有抗血小板聚集作用的新型噻吩并吡啶類化合物，并對(duì)其抗血栓作用及體內(nèi)代謝進(jìn)行初步研究。 方法：用體外抗血小板聚集實(shí)驗(yàn)篩選獲得具有抗血小板聚集作用的候選化合物，并對(duì)篩選得到的具有抗血小板聚集作用的2個(gè)不同結(jié)構(gòu)類型的化合物——YX-TP03、YX-TP16進(jìn)行體外抗血小板聚集時(shí)-效關(guān)系實(shí)驗(yàn)；對(duì)篩選得到的候選化合物進(jìn)行離體抗血小板聚集實(shí)驗(yàn)，初步探索其體內(nèi)代謝過(guò)程；篩選得到的候選化合物進(jìn)行出血時(shí)間(bleeding time，BT)實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)其對(duì)BT的影響；建立角叉菜膠致小鼠尾動(dòng)脈血栓模型，評(píng)價(jià)篩選得到的候選化合物抗血栓作用。 結(jié)果： 1.篩選并獲得5個(gè)具有抗血小板聚集作用的候選化合物——YX-TP03、YX-TP07、YX-TP08、YX-TP10、YX-TP16 應(yīng)用體外抗血小板聚集實(shí)驗(yàn)篩選、獲得5個(gè)具有抗血小板聚集活性的新型噻吩并吡啶類化合物——YX-TP03、YX-TP07、YX-TP08、YX-TP10、YX-TP16，同等劑量下5個(gè)化合物的抗血小板聚集作用均與阿司匹林相當(dāng)，較氯吡格雷弱。 2. YX-TP03及YX-TP16的體外抗血小板聚集效應(yīng)存在時(shí)間相關(guān)性 小鼠灌胃給藥后2h，YX-TP03(15mg/kg)表現(xiàn)出抑制血小板聚集趨勢(shì)，給藥后4h產(chǎn)生抗血小板聚集活性，該作用在給藥后8h達(dá)到最大；YX-TP16(15mg/kg)在給藥后1h開(kāi)始表現(xiàn)出抑制血小板聚集趨勢(shì)，給藥后2h產(chǎn)生抗血小板聚集活性，該作用在給藥后8h達(dá)到最大。 3. YX-TP10具有離體抗血小板聚集作用，YX-TP03、YX-TP07、YX-TP08、YX-TP16則無(wú)此作用 對(duì)篩選得到的5個(gè)候選化合物進(jìn)行離體抗血小板聚集實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示：同氯吡格雷相似，化合物YX-TP03(300μM)、YX-TP07(300μM)、YX-TP08(300μM)、YX-TP16(300μM)均無(wú)離體抗血小板聚集作用，提示此4個(gè)化合物均為前藥，須經(jīng)體內(nèi)代謝產(chǎn)生活性代謝產(chǎn)物發(fā)揮抗血小板聚集作用；化合物YX-TP10(300μM)與阿司匹林相似，可直接作用于離體血小板，產(chǎn)生抗血小板聚集作用。 4. YX-TP03可延長(zhǎng)小鼠BT YX-TP03(21mg/kg)可顯著延長(zhǎng)BT，YX-TP07(21mg/kg)、YX-TP10(21mg/kg)表現(xiàn)出一定的延長(zhǎng)BT趨勢(shì)，YX-TP08(21mg/kg)、YX-TP16(21mg/kg)對(duì)BT無(wú)影響。 5. YX-TP03、YX-TP10具有一定的抗血栓作用 YX-TP03(21mg/kg)、YX-TP10(21mg/kg)均可顯著縮短角叉菜膠致小鼠尾動(dòng)脈血栓的長(zhǎng)度，提示YX-TP03及YX-TP10具有抗血栓的作用。同等劑量下，兩者的抗血栓作用弱于氯吡格雷；與阿司匹林相比，血栓的發(fā)生率較后者高，但血栓長(zhǎng)度較阿司匹林給藥小鼠短。YX-TP03的抗血栓作用存在劑量依賴性，7mg/kg即可產(chǎn)生抗血栓作用，63mg/kg抗血栓活性最強(qiáng)，劑量繼續(xù)增加時(shí)抗血栓作用消失。此外，角叉菜膠給予前1h或角叉菜膠注射后24h給予YX-TP03(21mg/kg)均具有抗血栓作用，角叉菜膠注射前24h給予YX-TP03(21mg/kg)無(wú)抗血栓作用，此結(jié)果與YX-TP03的體外抗血小板聚集時(shí)-效關(guān)系結(jié)果一致。 結(jié)論： 1.本研究共篩選獲得5個(gè)具有抗血小板聚集作用的新型噻吩并吡啶類化合物——YX-TP03、YX-TP07、YX-TP08、YX-TP10、YX-TP16。 2. YX-TP03具有與阿司匹林相當(dāng)?shù)目寡“寰奂⒀娱L(zhǎng)BT、抗血栓作用。YX-TP03無(wú)離體抗血小板聚集作用，推測(cè)其為前藥，需經(jīng)體內(nèi)代謝產(chǎn)生活性產(chǎn)物發(fā)揮作用。 3．YX-TP10可直接作用于離體血小板發(fā)揮抗血小板聚集及抗血栓作用。 第二部分新型噻吩并吡啶類化合物內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用篩選及其機(jī)制的初步研究 目的：篩選出具有內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用的新型噻吩并吡啶類化合物，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步研究。 方法：建立高糖或氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)損傷模型，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(Cell Counting Kit-8，CCK-8)檢測(cè)細(xì)胞活力篩選出具有內(nèi)皮保護(hù)作用的候選化合物；用篩選得到的3個(gè)候選化合物處理高糖或ox-LDL損傷的HUVEC，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)HUVEC胞內(nèi)細(xì)胞間粘附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)、血管細(xì)胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)、單核細(xì)胞趨化因子-1(monocytechemotactic protein-1，MCP-1) mRNA的表達(dá)，進(jìn)一步明確其內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用，并對(duì)其抗炎作用機(jī)制進(jìn)行初步研究；篩選得到的3個(gè)候選化合物處理高糖或ox-LDL損傷的HUVEC，用熒光法一氧化氮(nitric oxide，NO)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清一氧化氮水平，對(duì)化合物內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用機(jī)制進(jìn)行初步研究；篩選得到的3個(gè)候選化合物直接處理HUVEC，通過(guò)細(xì)胞活力試驗(yàn)對(duì)其促增殖作用進(jìn)行研究。 結(jié)果： 1. YX-TP03、YX-TP12、YX-TP13具有抗高糖或ox-LDL導(dǎo)致的HUVEC損傷的作用 葡萄糖(45mM)或ox-LDL (150μg/ml)可導(dǎo)致HUVEC細(xì)胞活力下降，造成EC損傷。應(yīng)用兩種細(xì)胞損傷模型，篩選、獲得3個(gè)具有內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用的新型噻吩并吡啶類化合物——YX-TP03、YX-TP12、YX-TP13。 2. YX-TP03、YX-TP12、YX-TP13均可抑制高糖或ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC胞內(nèi)ICAM-1、VCAM-1、MCP-1mRNA表達(dá)的上調(diào) 葡萄糖(45mM)或ox-LDL (100μg/ml)處理后，HUVEC胞內(nèi)ICAM-1、VCAM-1、MCP-1mRNA的表達(dá)上調(diào)；YX-TP03(100μM)、YX-TP12(300μM)、YX-TP13(100μM)均可抑制高糖或ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC胞內(nèi)ICAM-1、VCAM-1、MCP-1mRNA表達(dá)的上調(diào)。其作用與抗氧化維生素C (Vitamin C，Vc)相當(dāng)，且與Vc相比，此3個(gè)化合物下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)VCAM-1、MCP-1mRNA的作用更為顯著。 3. YX-TP03、YX-TP12、YX-TP13均可對(duì)抗高糖或ox-LDL抑制HUVEC釋放NO的作用 葡萄糖(45mM)或ox-LDL (75μg/ml)均可造成HUVEC NO釋放的降低，YX-TP03(100μM)、YX-TP12(300μM)、YX-TP13(100μM)均可抑制此二者誘導(dǎo)的HUVEC NO釋放的降低。 4. YX-TP03、YX-TP12、YX-TP13具有促EC增殖作用 YX-TP03(100μM)、YX-TP12(300μM)、YX-TP13(100μM)均具有促進(jìn)基礎(chǔ)狀態(tài)HUVEC增殖的作用。 結(jié)論： 1. YX-TP03、YX-TP12、YX-TP13具有抗高糖或ox-LDL所致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用；基礎(chǔ)狀態(tài)下，此3化合物具有促內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用。 2. YX-TP03、YX-TP12、YX-TP13可能通過(guò)調(diào)節(jié)胞內(nèi)粘附分子及趨化因子表達(dá)而發(fā)揮其抗炎、抗AS作用。 3. YX-TP03、YX-TP12、YX-TP13促HUVEC釋放NO的作用可能是其發(fā)揮內(nèi)皮保護(hù)作用的機(jī)制之一。 綜上所述，本研究工作的主要?jiǎng)?chuàng)新之處在于： 具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型噻吩并吡啶類化合物YX-TP03兼具抗血小板聚集、延長(zhǎng)BT、抗血栓及血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用，故推測(cè)YX-TP03可能具有較好的AS的防治作用。 化合物YX-TP10可直接作用于離體血小板，產(chǎn)生抗血小板聚集及抗血栓作用，且其潛在的代謝優(yōu)越性可能使之成為新一代的有效的抗血小板治療藥。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R96

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2475572