本文選題：阿爾茨海默病　切入點(diǎn)：吡咯喹啉醌　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2013年博士論文

【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,臨床上以進(jìn)行性的認(rèn)知功能損害和特征性的病理學(xué)改變?yōu)橹饕卣鳌Ｆ駷橹?仍然缺乏有效的防治阿爾茨海默病的藥物和治療手段,目前臨床使用的腦內(nèi)膽堿酯酶抑制劑(如石杉堿甲和多奈哌齊等)和非競爭性NMDA受體拮抗劑(美金剛)并不能阻止AD病情的進(jìn)展；被認(rèn)為最有前景的p-淀粉樣蛋白(β-amyloid,Ap)疫苗治療也被證明不能抑制癡呆癥狀和病情的進(jìn)展,盡管它確實(shí)有清除腦內(nèi)Ap沉積和老年斑的作用,近年來,基于Ap假說研究的諸多新藥臨床試驗(yàn)相繼失敗促使我們反思目前的AD治療研究策略,尋找低毒、多作用靶點(diǎn)的新藥或“雞尾酒療法”成為AD防治研究中的熱點(diǎn)。 糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3,GSK-3)是一種多功能的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,是參與糖代謝的主要限速酶之一。GSK-3在腦中高表達(dá),除了參與糖代謝外,還與很多生理病理學(xué)過程相關(guān)。近年來的研究發(fā)現(xiàn),GSK-3也是參與AD發(fā)病過程的重要因素,AD患者腦內(nèi)GSK-3活性顯著增高,GSK-3信號通路能通過雙通道作用機(jī)制同時(shí)調(diào)控Aβ產(chǎn)生和Tau蛋白磷酸化而受到AD研究學(xué)者的廣泛重視。因此,通過調(diào)制GSK-3信號通路功能防治AD被賦予極高的期望。然而,包括氯化鋰等在內(nèi)的、目前已知的GSK-3抑制劑由于毒性過大而限制了其臨床應(yīng)用。鋰鹽作為第一個(gè)被證明的GSK-3抑制劑雖然用于臨床治療雙相精神障礙已經(jīng)超過50年,但由于極窄的治療窗和對老年人群過大的副作用而難以用于AD的臨床治療。因而,尋找低毒性的GSK-3抑制劑也成為AD研究熱點(diǎn)之一。 吡咯喹啉醌三鋰(tri-lithium pyrroloquinoline quinonein, Li3PQQ,分子式：C14H3N2O8Li,分子量：348)是我們自己合成的、具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的小分子有機(jī)鋰鹽。鋰鹽作為GSK-3抑制劑已經(jīng)證明顯著抑制Aβ沉積和Tau蛋白磷酸化、減少它們在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)外的沉積和改善胰島素抵抗與糖代謝紊亂的作用。吡咯喹啉醌作為新近發(fā)現(xiàn)的B族維生素,被證明具有顯著促進(jìn)細(xì)胞線粒體增生和功能、拮抗氧化損傷、減少Ap集聚和毒性等多種作用。因而,Li3PQQ兼具改善線粒體功能、抗氧化損傷和抑制GSK-3介導(dǎo)的tau蛋白磷酸化與Ap形成、抑制神經(jīng)變性性病理損害發(fā)生等作用,是有效的多靶點(diǎn)防治AD候選藥物之一。這里,我們采用昆明鼠進(jìn)行急性毒性試驗(yàn),研究Li3PQQ的毒性作用；利用APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型研究Li3PQQ的藥理藥效以及作用機(jī)制。 論文的第一部分研究Li3PQQ急性毒性試驗(yàn)及對血液學(xué)相關(guān)指標(biāo)的影響：①通過觀察昆明鼠口服受試物L(fēng)i3PQQ后的中毒反應(yīng)及死亡情況,用于初步評價(jià)受試物安全性,并為后續(xù)試驗(yàn)的劑量設(shè)計(jì)提供參考依據(jù)。挑選健康昆明小鼠,采用上下法,根據(jù)在AOT425StatPgm1.0中設(shè)定的給藥劑量給藥,同時(shí)設(shè)陽性對照氯化鋰(lithium chloride, LiCl)組。Li3PQQ按790mg/kg、2500mg/kg給藥后10-15min觀察到部分小鼠活動(dòng)減少,約20min～1h后恢復(fù)；5000mg/kg給藥后10min左右觀察到活動(dòng)減少和閉眼,部分動(dòng)物約2小時(shí)后恢復(fù),部分動(dòng)物在給藥后死亡,死亡發(fā)生在48小時(shí)以內(nèi)。LiCl370mg/kg,1160mg/kg給藥后無明顯異常,5000mg/kg組全部死亡,死亡發(fā)生在給藥后2-20小時(shí)內(nèi),Li3PQQ組雄性("g2500mg/kg)及雌性(5000mg/kg)與較低劑量組(790mg/kg)相比體重增長緩慢。本次試驗(yàn)測得Li3PQQ的半數(shù)致死量(Median lethal dose,LD50)為雄性5000mg/kg,雌性5000mg/kg(95%可信區(qū)間為3308mg/kg～5400mg/kg)。陽性對照品LiCl的LD50為2512mg/kg(95%可信區(qū)間為1160mg/kg～5000mg/kg)。②通過檢測給予Li3PQQ1.5、3、6rng/kg8周的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的血常規(guī)及生化指標(biāo),來評價(jià)L13PQQ的毒性作用。20周齡的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因及同窩野生型對照小鼠分別給予Li3PQQ1.5、3、6mg/kg,安理申(donepezil,DNP)1.5mg/kg,美金剛(memantine, MMT)3mg/kg,野生型溶劑(WT, vehicle)組,轉(zhuǎn)基因溶劑(TG, vehicle)組。給藥8周后取血檢測血常規(guī),肝腎功,血糖,血甘油三酯,膽固醇等指標(biāo),發(fā)現(xiàn)Li3PQQ三個(gè)劑量組均不影響APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的血常規(guī)及生化指標(biāo),為證實(shí)其毒性及副作用小又提供了一個(gè)有力的證據(jù)。 論文的第二部分研究Li3PQQ的藥效作用、改善認(rèn)知功能研究及突觸可塑性研究。以不同年齡(20周齡、40周齡)的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠為研究對象,采取灌胃的給藥方式,分別給予Li3PQQ1.5mg、3mg/kg、6mg/kg、12mg/kg,陽性對照藥安理申(donepezil, DNP)1.5mg/kg,鋰鹽對照藥LiCl5mg/kg、100mg/kg,吡咯喹啉醌對照組Na3PQQ14mg/kg,野生型溶劑(WT, vehicle)組,轉(zhuǎn)基因溶劑(TG, vehicle)組。給藥8周后,進(jìn)行Morris水迷宮行為學(xué)試驗(yàn),研究Li3PQQ不同劑量組空間學(xué)習(xí)記憶功能的變化；同時(shí)研究APP/PS1小鼠海馬CA1區(qū)0節(jié)律刺激(Theta-burst stimulate,TBS)誘導(dǎo)的長時(shí)程增強(qiáng)的變化,進(jìn)行突觸可塑性研究。研究證實(shí)：Li3PQQ3mg/kg,6mg/kg口服給藥8周均能改善20周齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶損害,同時(shí)Li3PQQ12mg/kg口服給藥8周均能改善20周齡、40周齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶損害及海馬CA1區(qū)的長時(shí)期增強(qiáng),增強(qiáng)其突觸可塑性。 本論文的第三部分及第四部分研究Li3PQQ給藥后APP/PS1小鼠的病理學(xué)表現(xiàn)及作用機(jī)制。采用免疫組織化學(xué)染色檢測AD的兩大病理指標(biāo)：淀粉樣斑塊和神經(jīng)原纖維纏結(jié),酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測皮層的Aβ1-42含量,免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測皮層的磷酸化tau蛋白含量；同時(shí)通過免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)和酶活試劑盒檢測GSK-3,GSK-3α, GSK-3β,β淀粉樣結(jié)合乙醇脫氫酶(Aβ-binding alcohol dehydrogenase,ABAD)的表達(dá)量及活性,探討相關(guān)作用機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)Li3PQQ3、6、12mg/kg均能夠減少APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠皮層淀粉樣斑塊的數(shù)目、面積及磷酸化tau蛋白的表達(dá)量,而這一作用是通過抑制GSK-3、GSK-3α、GSK-3β的活性及增強(qiáng)ABAD的活性來實(shí)現(xiàn)的。 本文通過急性毒性試驗(yàn)及血液生化指標(biāo)檢測證實(shí)Li3PQQ是低毒的有機(jī)小分子鋰鹽,同時(shí)又利用不同年齡段的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型研究其藥理藥效和相關(guān)的作用機(jī)制,從而證實(shí)吡咯喹啉醌三鋰是低毒、高效的多靶點(diǎn)治療AD的候選分子,有可能給AD病程修飾治療帶來突破性影響,產(chǎn)生巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。
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【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R965

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 ;Benfotiamine prevents increased β-amyloid production in HEK cells induced by high glucose[J];Neuroscience Bulletin;2012年05期

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本文編號：1719567