本文選題：結(jié)核分枝桿菌　切入點：肺結(jié)核　出處：《南方醫(yī)科大學》2016年博士論文

【摘要】：研究背景結(jié)核病(Tuberculosis, TB)是因人體感染結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterial tuberculosis, MTB)而發(fā)生的慢性傳染病,主要病灶是肺部,稱為肺結(jié)核(Pulmonary tuberculosis, PTB)。近年來,隨著人口流動的增加、HIV與MTB伴發(fā)感染、耐多藥(multidrug-resistant)和廣譜耐藥(extensively drug-resistant)菌株的流行,使全球結(jié)核病死灰復燃,呈現(xiàn)卷土重來之勢。全球1/3的人口感染了MTB,2014年新發(fā)結(jié)核病例960萬、因結(jié)核病死亡150萬。我國是全球第二大結(jié)核病高負擔國,45%的人口感染了MTB,每年新發(fā)結(jié)核病例100萬、因結(jié)核病死亡5萬,相當于每10分鐘就有1人死于結(jié)核!結(jié)核病嚴重危害人類健康,已成為重大的公共衛(wèi)生問題和社會問題!快速、靈敏的診斷方法缺乏,造成結(jié)核病診斷延誤或誤診。盡管抗生素的發(fā)明曾一度控制結(jié)核病的流行,但抗生素的用藥療程長達半年乃至一年,副作用明顯,而且越來越多的結(jié)核病患者對多種抗生素產(chǎn)生了耐藥性。據(jù)WHO統(tǒng)計,全球3.3%的新發(fā)病例和20%的復發(fā)病例為耐多藥結(jié)核,其中9.7%為廣譜耐藥結(jié)核；我國是全球耐多藥結(jié)核負擔最重的國家之一,每年新發(fā)耐多藥結(jié)核患者12萬、廣譜耐藥結(jié)核患者近1萬；前者治愈率不足50%,即使治愈后,人體很難完全清除體內(nèi)的MTB,在自身免疫力降低時,容易復發(fā)；后者則基本無藥可治。因此,疫苗仍是控制結(jié)核病流行的最佳策略。目前臨床上唯一使用的卡介苗(BCG)在數(shù)十年的反復傳代和保存中,已經(jīng)缺失了一些毒力因子和免疫保護作用基因,以及環(huán)境分枝桿菌的干擾,使得BCG的保護效果更差,僅對預防兒童重癥結(jié)核有效,對成人肺結(jié)核無顯著的保護作用。因此,研制新型診斷試劑和疫苗勢在必行!結(jié)核桿菌屬于胞內(nèi)寄生菌,體液免疫對其作用有限,在抗結(jié)核免疫反應中,作用最關(guān)鍵的是特異性T細胞,包括CD4+Th1和CD8+T細胞�；罨腃D4+Th1釋放IFN-γ、TNF-α等細胞因子,激活和趨化巨噬細胞,提高其對胞內(nèi)結(jié)核菌的殺滅和抗原遞呈能力。CD8+T細胞則發(fā)揮其細胞毒作用,特異識別和殺傷靶細胞,暴露并清除胞內(nèi)寄生的結(jié)核桿菌。特異CD4+Th1和CD8-T細胞無法識別完整的結(jié)核抗原,僅識別由MHC分子遞呈的抗原表位。因此,表位才是結(jié)核蛋白抗原性的基礎(chǔ)。確定T細胞表位,對于表位疫苗設(shè)計、結(jié)核診斷試劑開發(fā)具有十分重要的意義。T細胞表位(epitope)是抗原中被T細胞表面受體(T cell receptor, TCR)特異性識別的抗原部分,又稱為抗原決定簇。T細胞表位與MHC分子結(jié)合,通過與TCR相互作用,活化T細胞。目前,已知的MTB特異性T細胞表位約有800個,分布在170個不同的抗原蛋白；其中65%的已知表位集中來自30個最著名的MTB抗原,如ESAT-6、CFP-10和PPE家族蛋白,對于其它MTB抗原的表位,目前所知甚少。集中的抗原譜導致過窄的免疫應答,容易引起免疫耐受,不利于機體有效地抗結(jié)核。從MTB基因組選擇抗原,篩選和鑒定抗原表位,有助于“拓寬”現(xiàn)有表位的免疫保護效應。T細胞表位是通過MHC分子提呈的,即具有MHC限制性。大量已知的MTB抗原表位是歐美白種人群攜帶MHC分子(如HLA-A*0201)遞呈的；結(jié)核感染最嚴重的地區(qū)是非洲和東南亞等欠發(fā)達的國家和地區(qū),適用于這些地區(qū)人群的T細胞表位嚴重缺乏。中國是世界上第二大結(jié)核高負擔國,篩選和鑒定中國人群高頻HLA提呈的MTB表位,有助于促進具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的抗結(jié)核疫苗和診斷試劑的研發(fā)。近年來,基于肽與MHC分子結(jié)合親和力的表位預測,成為了表位篩選和鑒定的熱點。目前,大部分的表位研究都是通過生物信息學預測獲得高親和力的候選表位,然后人工合成肽,逐一驗證。傳統(tǒng)的親和力驗證實驗是一個費時費力的過程,利用紫外誘導肽置換技術(shù),能快速、準確、大規(guī)模地驗證表位與MHC分子的親和力,更高效地找到免疫優(yōu)勢表位。本課題組從MTB全基因組選擇目標抗原,運用生物信息學軟件預測聯(lián)合紫外誘導肽置換實驗驗證,初步篩選出與中國人群高頻HLA分子高親和結(jié)核的候選T細胞表位；進而利用臨床樣本,驗證其抗結(jié)核免疫活性；并且利用肽-MHC多聚體,在肺結(jié)核患者外周血中檢測到抗原特異性T細胞。本實驗組最終鑒定出6條新的CTL表位和3條新的Thl表位,為研發(fā)適用于中國人群的肽表位疫苗、結(jié)核診斷試劑奠定重要基礎(chǔ)。研究目的1.篩選和鑒定覆蓋最廣泛中國人群的HLA-A*1101限制性CTL表位,并且評價其抗結(jié)核免疫效應。2.篩選和鑒定覆蓋最廣泛中國人群的HLA-DRB1*0901限制性Th1表位,并且評價其抗結(jié)核免疫效應。研究方法1.檢測結(jié)核患者HLA-A、HLA-DR等位基因頻率T細胞表位的識別和遞呈有MHC限制性。不同區(qū)域的人群,攜帶的HLA等位基因有很大差異。為了鑒定能夠覆蓋最廣泛的中國人群T細胞表位,我們檢測中國人群的HLA基因頻率,尋找等位基因頻率最高的HLA分型。我們從南方醫(yī)院和廣州市胸科醫(yī)院一共收集了350名結(jié)核患者的外周血樣本,利用測序分型技術(shù)(SBT),對結(jié)核患者HLA-A、HLA-DR位點進行高分辨基因分型檢測。2.預測CTL表位和Th表位1) HLA-A*1101限制性CTL表位的預測①從Anat Zvi, ect al篩選的具有免疫優(yōu)勢的抗原中選擇了45個MTB抗原蛋白：從Sylvie Bertholet, ect al鑒定的誘導IFN-γ分泌的抗原中選擇了16個MTB抗原蛋白；另外,通過PubMed檢索2008至2013年間報道新的MTB抗原蛋白,選擇了33個MTB抗原蛋白。綜上所述,最終篩選獲得94個MTB抗原。②從結(jié)核數(shù)據(jù)庫TB Database獲取94個MTB抗原的氨基酸序列；使用CBS數(shù)據(jù)庫上NetMHCcons方法預測HLA-A*1101限制性CTL表位。選取與HLA-A*1101分子親和力最高的48條表位肽。2) HLA-DRB1*0901限制性Th表位的預測①選擇了強免疫原性并廣泛應用的MTB抗原38kDa (Rv0934)和Ag85A (Rv3804c)。目前表位數(shù)據(jù)庫IEDB尚未有這兩個抗原HLA-DRB1*0901限制性T細胞表位研究報道。②從TB Database獲取38kDa和Ag85A的氨基酸序列；使用CBS數(shù)據(jù)庫上NetMHCII方法預測抗原上的Th表位,選取與HLA-DRB1*0901分子親和力最高的18個表位。3. HLA-A*1101限制性CTL表位的篩選和鑒定1)紫外誘導肽置換實驗驗證CTL表位與HLA-A*1101分子的親和力合成含光敏型配體的p-MHC單體,將其與預測的CTL表位肽混合,紫外照射1小時。光敏型配體發(fā)生斷裂而從MHC分子脫離,CTL表位與MHC分子結(jié)合形成新的p-MHC單體,并且親和力越高,形成的單體越多越穩(wěn)定。使用MHCI特異性ELISA檢測新形成的p-MHC單體的量,確定預測的CTL與HLA-A*1101分子之間的親和力。2) ELISA檢測CTL、Th表位誘導肺結(jié)核患者PBMC分泌細胞因子CTL表位肽刺激6名HLA-A*1101(+)確診結(jié)核患者的PBMC細胞。72小時后,ELISA檢測上清中IFN-γ、TNF-α和GrB的分泌水平。3)ELISPOT檢測分泌IFN-γ的CD8+T細胞頻數(shù)及患者識別陽性率CTL表位肽刺激30名HLA-A*1101(+)肺結(jié)核患者的PBMC細胞,在ELISPOT板孵育24小時,檢測生成的斑點數(shù)。設(shè)置陽性反應的標準,統(tǒng)計各CTL表位肽被患者識別的陽性率。4)CTL表位誘導肺結(jié)核患者CD8+T細胞增殖用CTL表位肽刺激來自HLA-A*1101(+)肺結(jié)核患者、HLA-A*1101(-)肺結(jié)核患者和HL-A*1101(+)健康志愿者的PBMC細胞,用CFSE對淋巴細胞進行染色,7天后,流式細胞術(shù)檢測CD8+T細胞的增殖水平。5)表位肽-MHC多聚體檢測肺結(jié)核患者肽特異性T細胞合成帶APC熒光的HLA-A*1101多聚體(裝載CTL表位p12),用于標記p12特異性T細胞。用多聚體標記4名肺結(jié)核患者的PBMC,流式細胞術(shù)檢測p12特異性T細胞的百分比。6)檢測CTL表位肽p12誘導CD69和CD107分子的表達及胞內(nèi)細胞因子分泌用p12刺激HLA-A*1101肺結(jié)核患者的PBMC,6小時后,用表面標記抗體檢測T細胞早期活化標志CD69和溶酶體相關(guān)膜蛋白CD107的表達水平。將T細胞破膜固定后,檢測胞內(nèi)IFN-γ、TNF-α和IL-2的表達水平。4.HLA-DRB1*0901限制性CD4+T細胞篩選和驗證1) ELISA檢測Th表位誘導Th1型細胞因子分泌用Th表位刺激10名HLA-DRB1*0901肺結(jié)核患者的PBMC細胞,72小時后,ELISA檢測上清中Th1型細胞因子IFN-γ、TNF-α和Th2型細胞因子IL-4、IL-17的分泌水平。2) ELISPOT檢測分泌IFN-γ的CD4+T細胞頻數(shù)用Th1表位刺激來自HLA-DRB1*0901(+)和HLA-DRB1*0901(-)肺結(jié)核患者的PBMC,在ELISPOT板孵育24小時后,檢測生成的斑點數(shù)。3)Th1表位肽誘導肺結(jié)核患者CD4+T細胞增殖用Th1表位肽刺激來自HLA-DRB1*0901(+)和HLA-DRB1*0901(-)肺結(jié)核患者的PBMC,使用CFSE染料標記細胞,7天后,流式細胞術(shù)檢測CD4+T細胞的增殖水平。4)ICS檢測Th1表位誘導細胞因子分泌用HLA-DRB1*0901限制性Th1表位肽p2刺激肺結(jié)核患者的PBMC,6小時后,檢測胞內(nèi)IFN-γ、TNF-α和IL-2的表達水平。統(tǒng)計學分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。所有計量資料結(jié)果用均數(shù)±標準差(standard error, mean±SE)表示。不同組之間的比較使用單因素方差分析(One-way ANOVA),多個實驗組與一個對照組的均值比較方差齊時采用Dunnett-t檢驗,各組間兩兩比較方差齊時采用LSD法。兩樣本間的均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗(Independent-samples T Test)。當P0.05時,被認為差異具有顯著意義。結(jié)果1.獲得了中國結(jié)核患者HLA-A、HLA-DR等位基因頻率分布為獲得結(jié)核患者中HLAⅠ、Ⅱ類等位基因的頻率,利用測序分型技術(shù)(SBT),對中國南方地區(qū)350名結(jié)核患者進行HLA-A、HLA-DR位點高分辨基因分型檢測,證實頻率最高的前五位與HLA等位基因權(quán)威數(shù)據(jù)庫AFND (http://www.allelefrequencies.net)中國人群的結(jié)果一致。其中HLA-A*1101和HLA-DRB1*0901分別是HLA-A位點和HLA-DRB1位點等位基因頻率最高的基因型,能夠覆蓋最廣泛的中國人群。2.MTB抗原特異性CTL和Th1表位的預測和鑒定1)HLA-A*1101限制性MTB抗原CTL表位的預測和鑒定①抗原選擇：通過篩選抗原的方法和設(shè)置的標準,獲得了Rv0079等94個能夠誘導人CD8+T細胞反應的MTB抗原。② HLA-A*1101表位：從結(jié)核數(shù)據(jù)庫(TB Database)獲得94個MTB抗原蛋白的氨基酸序列,采用CBS數(shù)據(jù)庫中的NetMHCcons預測方法,預測與HLA-A*1101分子高親和力的表位。選擇了親和力最強的48條表位,這些表位肽的IC5015nM。2) HLA-DRB1*0901限制性Th表位的預測和鑒定①抗原選擇：通過檢索IEDB,發(fā)現(xiàn)常見MTB抗原38kDa (Rv3804)和Ag85A(Rv0934c)并沒有HLA-DRB1*0901限制性表位的報道,于是選取它們作為目標抗原。② HLA-DRB1*0901表位：從結(jié)核數(shù)據(jù)庫(TB Database)獲得了38kDa和Ag85A的氨基酸序列,通過CBS數(shù)據(jù)庫中NetMHCIIpan預測方法,預測與HLA-DRB1*0901分子結(jié)合的表位。我們選取了IC5050nM的高親和力表位肽,共計18條。3. HLA-A*1101限制性CTL表位的篩選及其免疫學功能驗證1)通過紫外誘導肽置換實驗,驗證48條CTL表位肽與HLA-A*1101分子結(jié)合親和力,其中22條預測表位肽與HLA-A*1101分子有強親和力(陽性對照肽),將預測表位肽的序列與MTB蛋白組比對,確認了預測表位肽MTB蛋白來源的唯一性。2)通過不同的實驗方法(ELISA法、ELISPOT法和ICS法)檢測了22條預測表位肽活化CD8+T細胞和誘導細胞因子反應,發(fā)現(xiàn)其中6條表位肽特異性地誘導肺結(jié)核患者CD8+T細胞分泌IFN-γ (P0.05)。3)為驗證6條免疫優(yōu)勢的CTL表位肽的MTB特異性和HLA-A*1101限制性,檢測表位肽誘導HLA-A*1101(+)肺結(jié)核患者、HLA-A*1101(-)肺結(jié)核患者和HLA-A*1101(+)健康志愿者的PBMC中分泌IFN-y的CD8+T細胞的頻數(shù)。結(jié)果顯示,6條抗原表位肽刺激后,HLA-A*1101(+)肺結(jié)核患者PBMC中分泌IFN-y的CD8+T細胞的頻數(shù),顯著地高于其它兩組,結(jié)果具有統(tǒng)計學差異(P0.05)。4)為了進一步檢測6條優(yōu)勢表位肽的免疫學活性,我們檢測了它們誘導T淋巴細胞增殖的能力,發(fā)現(xiàn)它們能特異性地誘導HLA-A*1101(+)肺結(jié)核患者CD8+T細胞增殖(P0.05)。5)為了直接檢測表位肽特異性T細胞,合成了肽-MHC多聚體(dextramer),利用多聚體標記,在HLA-A*1101(+)的肺結(jié)核患者PBMC中檢測到顯著水平的表位肽p12特異性CD8+T細胞(P0.05)。6)流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明,優(yōu)勢表位肽p12誘導CD8+T細胞早期活化標志CD69分子和殺傷活性標志分子CD107a/b的表達上調(diào)；表位肽p12夠誘導肺結(jié)核患者產(chǎn)生同時分泌兩種或以上細胞因子的多功能CD8+T細胞。4.HLA-DRBl*0901限制性Thl表位的篩選及其免疫學功能驗證1)通過不同的實驗方法(ELISA和流式細胞術(shù))檢測18條Th表位肽誘導CD4+T細胞反應,發(fā)現(xiàn)其中6條誘導肺結(jié)核患者分泌Thl型細胞因子(P0.05)。2) ELISPOT檢測6條優(yōu)勢表位肽誘導HLA-DRB1*0901(+)和HLA-DRB1*0901(-)肺結(jié)核患者的IFN-γ反應,發(fā)現(xiàn)6條表位肽誘導的IFN-y反應均能被anti-CD4抗體阻斷(P0.05)；其中3條表位肽能特異性地誘導HLA-DRB1*0901(+)的肺結(jié)核患者PBMC分泌IFN-γ(P0.05).3)為進一步檢測上述3條HLA-DRB1*0901限制性CD4+T細胞優(yōu)勢表位肽的免疫學活性,檢測了它們誘導T細胞增殖的能力。結(jié)果顯示,3條優(yōu)勢表位肽能特異性誘導HLA-DRB1*0901(+)肺結(jié)核患者的CD4+T細胞發(fā)生顯著增殖,P0.05)。4)利用流式細胞術(shù),檢測到了表位肽p4夠誘導肺結(jié)核患者產(chǎn)生同時分泌兩種或以上細胞因子的多功能CD4+T細胞。結(jié)論1.通過HLA基因頻率測序分型,獲得了中國人群HLA-A和DR位點上的等位基因頻率,為鑒定覆蓋廣泛人群HLA的MTB表位奠定基礎(chǔ)。2.利用生物信息預測,結(jié)合實驗驗證的方法,鑒定了6條來自不同MTB抗原蛋白的HLA-A*1101限制性CTL表位；通過臨床樣本功能實驗,驗證了上述優(yōu)勢表位能誘導IFN-γ、TNF-α和GrB等細胞因子分泌,誘導CD8+T細胞增殖；通過肽-MHC多聚體標記,證實p12是自然遞呈的表位。這些HLA-A*1101限制性表位肽為進一步研發(fā)疫苗或診斷試劑奠定基礎(chǔ)。3.利用生物信息預測,結(jié)合實驗驗證的方法,鑒定了3條新的HLA-DRB1*0901限制性Thl表位,通過功能實驗證明上述表位肽能夠誘導IFN-γ、TNF-α等Thl型細胞因子分泌,誘導CD4+T細胞的增殖,為進一步研發(fā)多肽疫苗或診斷試劑奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R378.911

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本文編號：1667299