本文選題：日本血吸蟲　切入點：IL-37　出處：《安徽醫(yī)科大學》2017年博士論文

【摘要】：血吸蟲病(Schistosomiasis)是一種嚴重危害流行區(qū)人民健康和阻礙社會經濟發(fā)展的熱帶病。該病主要分布于亞洲、非洲及拉丁美洲的76個國家和地區(qū),患病人數(shù)達2億以上。血吸蟲病也是威脅我國人民健康的重要寄生蟲病,截至2015年底,據(jù)推算全國共約有7.7萬血吸蟲病人。雖然監(jiān)測資料顯示全國血吸蟲病疫情有下降趨勢,但血吸蟲病流行環(huán)節(jié)復雜、影響因素眾多,我國血吸蟲病防治工作仍面臨諸多嚴峻挑戰(zhàn)。因此,有效預防和治療血吸蟲病仍是當前研究的熱點和難點。血吸蟲病的主要危害是蟲卵肉芽腫病變和繼發(fā)性肝纖維化。巨噬細胞(Macrophage,M?)是肉芽腫組織的主要細胞成分,也是固有免疫的重要成分,同時還作為抗原遞呈細胞啟動并調節(jié)獲得性免疫應答,在蟲卵肉芽腫及纖維化形成和發(fā)展中發(fā)揮關鍵作用。雖然血吸蟲蟲卵肉芽腫的形成由嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞和肝星狀細胞等的共同參與,但是巨噬細胞發(fā)揮著重要的調節(jié)作用,巨噬細胞的極化狀態(tài)顯著影響肝臟蟲卵肉芽腫和纖維化的發(fā)生、發(fā)展和轉歸,從而顯著影響血吸蟲感染后對宿主的致病及其后果。尤其M2型巨噬細胞對宿主度過血吸蟲病急性期至關重要,若能早期抑制M1型巨噬細胞的過度活化使其盡早向M2型極化,阻止炎癥重癥化,或可為臨床干預免疫炎癥導致肝纖維化的發(fā)生發(fā)展提供新的靶點和依據(jù)�？刂蒲x病患者的炎癥反應和適度抑制蟲卵肉芽腫的形成,巨噬細胞正是一個理想的靶向目標。已有研究提示,巨噬細胞的極化過程是可逆的,巨噬細胞的表型和功能的改變可能受局部一些細胞因子環(huán)境調控。只是目前在蟲卵肉芽腫和纖維化發(fā)生發(fā)展的不同時期,到底是哪些因素觸發(fā)巨噬細胞的表型和功能發(fā)生變化,尚未見系統(tǒng)深入的研究。全面了解血吸蟲蟲卵肉芽腫和纖維化發(fā)生發(fā)展中巨噬細胞的表型及功能改變原因,早期抑制M1型巨噬細胞的過度活化并/或使其盡早向M2型極化,阻止炎癥重癥化,將為減輕或抑制肉芽腫炎癥反應和肝纖維化提供新的思路。白細胞介素-37(Interleukin-37,IL-37)是IL-1家族的新成員,又被稱為IL-1F7。IL-37是近年來發(fā)現(xiàn)的一種能夠調節(jié)固有免疫和獲得性免疫應答的細胞因子,在各種炎性疾病和免疫性疾病中具有抑制炎癥作用。IL-37在可多種細胞中表達,主要表達于巨噬細胞、淋巴細胞、單核細胞、組織上皮細胞、滑膜細胞、間質細胞、腺細胞、角質形成細胞和樹突狀細胞等。成熟的IL-37可分泌到細胞外與細胞表面SIGIRR和IL-18Rα兩個受體亞基結合通過受體途徑進行免疫負調控作用;另外成熟的IL-37還可進入A549細胞和THP-1細胞的細胞核,與Smad3蛋白相互作用,通過核轉錄因子途徑抑制免疫應答。以往研究表明IL-37對巨噬細胞具有免疫調節(jié)作用,但IL-37是否影響巨噬細胞的極化以及作用機制目前尚未報道。我們推測在血吸蟲感染時,IL-37可能抑制M0極化為M1型巨噬細胞并介導M0較早向M2極化,從而抑制或減輕蟲卵肉芽腫引起的宿主過度的炎癥反應,使宿主順利度過血吸蟲感染急性期反應并減輕后期肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。由于市售的IL-37細胞因子的設計沒有體現(xiàn)其轉錄因子的作用,該細胞因子的成藥性可能被低估,而且不能從轉錄因子角度研究IL-37。為了深入研究IL-37如何抑制宿主血吸蟲肝纖維化的作用及其機制,本課題組主要成員美國Antagen制藥有限公司研發(fā)總監(jiān)及我校兼職教授高聞達自主設計并制備了轉染人CPP-IgG2Fc-IL-37的CHO細胞株和no CPP-IgG2Fc-IL-37的CHO細胞株。通過該兩株細胞的培養(yǎng),得到并純化出真核細胞表達的CPP-IgG2Fc-IL-37和no CPP-IgG2Fc-IL-37蛋白。其中h IL-37為人IL-37蛋白;CPP為細胞穿透肽(cell-penetrating peptide,CPP),有助于蛋白進入細胞內發(fā)揮作用;帶有IgG2Fc mut是為了避免產生ADCC或者CDC,延長IL-37蛋白的體內半衰期并有利于蛋白純化;同時還在CPP-IL-37和IgG2Fc之間設計了帶有WEHD氨基酸序列的caspase-1酶切位點。這樣CPP-IgG2Fc-IL-37蛋白可從細胞外通過CPP的作用轉導進入細胞內。進入細胞后,在caspase-1作用下使IL-37脫離IgG并能將IL-37遞送至細胞核內,發(fā)揮轉錄因子功能。也就是說CPP-IgG2Fc-IL-37蛋白既能遞送細胞表面信號又能遞送細胞內及核因子信號。而no CPP-IgG2Fc-IL-37蛋白因為沒有細胞穿透肽,也沒有蛋白酶切割位點,因此no CPP-IgG2Fc-IL-37蛋白僅與細胞表面IL-37受體結合而活化該受體信號通路。IL-37蛋白帶有CPP及Ig融合蛋白的原創(chuàng)性設計,其通過細胞表面膜受體或兼具核轉錄因子通路的作用機制能夠被充分研究。為了進一步確認IL-37是否能夠通過誘導巨噬細胞表型轉變從而改善宿主肝臟血吸蟲蟲卵肉芽腫和肝纖維化的作用及其機制,本研究分為3個部分:一、檢測血吸蟲急性感染病人和正常人血清中IL-37的表達情況,初步探討IL-37是否與血吸蟲感染具有相關性;二、利用C57BL/6小鼠制備日本血吸蟲感染模型,在感染后24天始分別給予重組IL-37(Recombinant IL-37,r IL-37)蛋白、CPP-IgG2Fc-IL-37蛋白(以下簡寫為CPP-IL-37)和no CPP-IgG2Fc-IL-37(以下簡寫為no CPP-IL-37)直至第6周,研究IL-37是否通過調節(jié)巨噬細胞表型轉變抑制宿主血吸蟲蟲卵肉芽腫形成及肝纖維化發(fā)展;三、在此基礎上,進一步以正常小鼠腹腔巨噬細胞為研究對象,分別加入rIL-37蛋白、no CPP-IL-37蛋白、CPP-IL-37蛋白及Smad3抑制劑SIS3等共培養(yǎng),探討該IL-37蛋白對巨噬細胞向M1/M2極化的影響,并探討IL-37對巨噬細胞極化的機制。一、檢測血吸蟲急性感染病人和正常人血清中IL-37的表達情況IL-37在炎性疾病和自身免疫性疾病的致病中扮演重要角色,且IL-37的表達水平與疾病的嚴重程度密切相關。本實驗收集14份日本血吸蟲急性感染病人血清和14份非流行區(qū)健康人血清,雙抗夾心ELISA檢測各組血清中IL-37的表達情況。結果發(fā)現(xiàn)健康對照組低表達IL-37,而急性日本血吸蟲感染患者血清中IL-37的表達量明顯升高(p0.05)。該實驗結果提示IL-37作為一種抗炎性細胞因子,可能通過某種負反饋調節(jié)機制抑制炎癥因子,與血吸蟲病的發(fā)病及病程進展存在一定關系,可能在血吸蟲蟲卵肉芽腫反應中起到抑制過度炎癥反應、保護宿主機體的作用。二、觀察IL-37處理后對小鼠肝臟血吸蟲蟲卵肉芽腫和肝纖維化的影響為了進一步明確IL-37在日本血吸蟲感染小鼠肝臟肉芽腫和肝纖維化病變中的作用,小鼠血吸蟲感染后第24d開始通過尾靜脈注射分別給予合適劑量的r IL-37、no CPP-IL-37或CPP-IL-37蛋白,每隔3d一次,于感染后42天剖殺小鼠,觀察血吸蟲感染小鼠經IL-37治療后對處理肉芽腫炎癥反應和肝纖維化的影響;并采用HE染色、Masson染色、qRT-PCR、FACS及免疫組化等技術從細胞、分子水平分析其機制。結果顯示:不同劑型的IL-37蛋白處理后對感染小鼠的蟲荷、卵荷、肝臟重量沒有明顯影響。但肉眼可見IL-37處理組小鼠肝臟大體外觀明顯改善,肝臟表面蟲卵結節(jié)減少;尤以CPP-IL-37蛋白治療組肝臟外觀改善最明顯。HE染色結果顯示不同劑型的IL-37蛋白處理組小鼠肝臟蟲卵肉芽腫中浸潤的炎性細胞明顯減少,肝細胞壞死明顯減輕,與感染對照組相比,發(fā)現(xiàn)IL-37處理組小鼠肝臟蟲卵肉芽腫面積明顯減小(p0.05);尤以CPP-IL-37蛋白處理組肉芽腫面積減小最為明顯,經統(tǒng)計學分析后三種不同的IL-37處理組之間肝臟蟲卵肉芽腫面積差異沒有顯著性(p0.05)。不同劑型的IL-37蛋白處理組小鼠血清中轉氨酶AST和ALT水平均明顯低于感染對照組(p0.05);其中CPP-IL-37蛋白和no CPP-IL-37蛋白處理組肝功能損害減輕最為明顯,rIL-37蛋白處理組肝功能損害恢復程度不如no CPP-IL-37蛋白和CPP-IL-37蛋白處理組(p0.05)。同時發(fā)現(xiàn)不同劑型的IL-37蛋白處理組與感染對照組相比,肝臟膠原纖維的間隔減少并變細(p0.05);其中CPP-IL-37蛋白處理組的纖維化面積減少最為明顯,IL-37蛋白處理組之間差別無統(tǒng)計學意義。接著我們通過免疫組化利用anti-α-SMA多抗檢測各組小鼠肝臟α-SMA的表達情況,發(fā)現(xiàn)不同劑型的IL-37蛋白處理后α-SMA蛋白的表達量比感染對照組顯著減少(p0.05);其中CPP-IL-37蛋白處理組α-SMA的表達減少最為明顯,三種IL-37蛋白處理組之間差別無統(tǒng)計學意義。而且不同劑型的IL-37蛋白處理組后與感染對照組相比小鼠肝臟組織中IL-17的mRNA明顯下調,而TGF-β的mRNA水平明顯上調(p0.05);更感興趣的是巨噬細胞M1細胞因子iNOS的mRNA水平也明顯下調,而巨噬細胞M2細胞因子Fizzl的mRNA水平高于感染對照組(p0.05)。FACS分析顯示不同劑型的IL-37蛋白處理后與感染對照組相比肝臟蟲卵肉芽腫細胞中Treg細胞數(shù)和細胞比例明顯多于感染組(p0.05);Th2細胞有所增多,而Th1細胞和Th17細胞有所減少,但感染鼠各組之間無統(tǒng)計學差異(p0.05);進一步分析發(fā)現(xiàn),CPP-IL-37處理組Treg細胞的比例顯著高于其他IL-37治療組(p0.05)。FACS分析同時還顯示不同劑型的IL-37蛋白處理后與感染對照組相比,M2型巨噬細胞數(shù)和細胞比例明顯增多(p0.05),經CPP-IL-37蛋白處理后M2比例升高的最多(p0.01)。以上結果揭示IL-37通過誘導巨噬細胞向M2極化進而影響其下游效應細胞(Th細胞)功能從而抑制血吸蟲蟲卵肉芽腫反應和肝臟纖維化,保護宿主肝臟功能。三、探討IL-37誘導巨噬細胞向M2極化的作用機制為了探究IL-37誘導巨噬細胞表型向M2轉變的機制,在體外分離和培養(yǎng)正常小鼠腹腔巨噬細胞(M0),分別用100ng/ml的rIL-37、20ng/ml的no CPP-IL-37蛋白、10ng/ml的CPP-IL-37蛋白或10ng/ml的CPP-IL-37蛋白+2μΜ的SIS3與M0共培養(yǎng)12h。因CPP-IL-37蛋白帶有CPP,有助于IL-37蛋白進入細胞及細胞核內發(fā)揮作用,為了觀察CPP-IL-37蛋白作為核轉錄因子的作用,在該實驗中加入Smad3的特異性抑制劑SIS3。FACS結果顯示不同劑型的IL-37蛋白作用于M0后,M0極化為M2的細胞比例與PBS對照組相比均明顯增多(p0.01);其中CPP-IL-37蛋白處理組誘導為M2型巨噬細胞的比例最大,與其他三組相比差異具有顯著性(p0.05)。該實驗結果說明IL-37可通過細胞表面受體信號通路及核轉錄因子途徑誘導巨噬細胞向M2極化。但M0預先用不同濃度的Compound C(AMPK抑制劑)處理后,CPP-IL-37蛋白誘導M0為M2的比例隨著AMPK抑制劑濃度的增加逐步下降。免疫印跡結果顯示用rIL-37、no CPP-IL-37和CPP-IL-37蛋白誘導巨噬細胞12h后,pAMPK蛋白的表達均明顯提高(p0.01),尤其CPP-IL-37蛋白處理組pAMPK蛋白的表達量最高(p0.01),經SIS3抑制后pAMPK的表達量與r IL-37和no CPP-IL-37蛋白處理組基本相似(p0.05)。說明IL-37能夠促進巨噬細胞內AMPK的活化,活化的AMPK能夠促進巨噬細胞向M2極化,從而調控機體過度的炎癥反應。總之,本研究首次描述了IL-37在急性血吸蟲感染患者的血清中含量明顯升高;C57BL/6小鼠感染日本血吸蟲后,經IL-37處理后小鼠的肝臟蟲卵肉芽腫和肝纖維化程度明顯減輕,小鼠肝臟和腹腔M2型巨噬細胞的比例明顯增多;體外實驗用IL-37誘導正常小鼠腹腔巨噬細胞向M2的極化的比例也明顯增多,同時IL-37處理后明顯促進巨噬細胞內AMPK的活化,Smad3能增強IL-37的抑炎功能。本研究還首次證明我們制備的CPP-IL-37蛋白使用較低的工作濃度卻發(fā)揮了更好的作用效果。擁有自主知識產權的no CPP-IL-37和CPP-IL-37蛋白不僅便于本課題的實施,通過不同劑型的比較,為今后開發(fā)IL-37-Ig融合蛋白作為原創(chuàng)性治療因過度免疫活化造成的各類疾病,打下機理研究的基礎。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R532.21

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 鄭振群;;關于巨噬細胞的幾個問題[J];山西醫(yī)藥雜志;1974年12期

2 ;豚鼠巨噬細胞經P_(204)處理后的抗石英細胞毒作用[J];國外醫(yī)學參考資料(衛(wèi)生學分冊);1976年04期

3 鄧俠進;;巨噬細胞的抗癌作用[J];遵義醫(yī)學院學報;1979年02期

4 陸天才;;疾病對肺巨噬細胞的影響[J];煤礦醫(yī)學;1982年01期

5 郭瑞清;祝彼得;;一種分離巨噬細胞的簡單方法[J];濱州醫(yī)學院學報;1990年02期

6 謝志堅;巨噬細胞異質性[J];醫(yī)學綜述;2001年06期

7 饒艷;運動及神經內分泌對巨噬細胞功能的調節(jié)[J];體育與科學;2002年05期

8 朱金元;;吸煙對肺巨噬細胞的影響[J];浙江醫(yī)學教育;2003年01期

9 張俊峰;過氧化物酶體增殖物激活受體與單核/巨噬細胞系[J];醫(yī)學綜述;2004年03期

10 韋錦學;顧軍;;巨噬細胞的激活誘導死亡[J];生命科學;2006年02期

相關會議論文 前10條

1 史玉玲;王又明;豐美福;;巨噬細胞激活作用的研究[A];中國細胞生物學學會第五次會議論文摘要匯編[C];1992年

2 吳國明;周輝;;巨噬細胞和創(chuàng)傷纖維化[A];2009年浙江省骨科學學術年會論文匯編[C];2009年

3 李奇;王海杰;;透明質酸對于淋巴結巨噬細胞運動的影響[A];解剖學雜志——中國解剖學會2002年年會文摘匯編[C];2002年

4 劉革修;歐大明;劉軍花;黃紅林;廖端芳;;丙丁酚在體外能抑制巨噬細胞脂質氧化介導的低密度脂蛋白氧化并調節(jié)氧化巨噬細胞的分泌功能[A];面向21世紀的科技進步與社會經濟發(fā)展（下冊）[C];1999年

5 葉金善;楊麗霞;郭瑞威;;環(huán)氧化酶-2/前列腺素E_2在血管緊張素Ⅱ刺激巨噬細胞表達細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子中的作用[A];第十三次全國心血管病學術會議論文集[C];2011年

6 秦帥;陳希;孔德明;;構建由綠色熒光標記巨噬細胞的轉基因斑馬魚系[A];貴州省中西醫(yī)結合內分泌代謝學術會論文匯編[C];2012年

7 武劍華;徐惠綿;;腫瘤相關巨噬細胞在胃癌中的相關研究[A];第9屆全國胃癌學術會議暨第二屆陽光長城腫瘤學術會議論文匯編[C];2014年

8 何軍;;血凝素樣氧化型低密度脂蛋白受體升高巨噬細胞內膽固醇水平[A];中華醫(yī)學會第11次心血管病學術會議論文摘要集[C];2009年

9 宋盛;周非凡;邢達;;PDT誘導的凋亡細胞對巨噬細胞NO合成的影響[A];第七屆全國光生物學學術會議論文摘要集[C];2010年

10 張磊;朱建華;黃元偉;姚航平;;血管緊張素Ⅱ對巨噬細胞(THP-1重細胞)凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體表達的影響[A];浙江省免疫學會第五次學術研討會論文匯編[C];2004年

相關重要報紙文章 前10條

1 通訊員 李靜 記者 胡德榮;惡性腫瘤巨噬細胞未必皆“惡人”[N];健康報;2014年

2 蘭克;以嘗試用巨噬細胞治癱瘓[N];科技日報;2000年

3 薛佳;免疫系統(tǒng)——人體的“衛(wèi)士”[N];保健時報;2009年

4 記者 胡德榮;鐵泵蛋白“維穩(wěn)”鐵代謝作用首次闡明[N];健康報;2011年

5 侯嘉 何新鄉(xiāng);硒的神奇功能[N];中國食品質量報;2003年

6 唐穎 倪兵 陳代杰;巨噬細胞泡沫化抑制劑研究快步進行[N];中國醫(yī)藥報;2006年

7 劉元江;新發(fā)現(xiàn)解釋腫瘤為何易成“漏網之魚”[N];醫(yī)藥經濟報;2007年

8 本報記者 侯嘉 通訊員 何新鄉(xiāng);今天你補硒了嗎[N];醫(yī)藥經濟報;2003年

9 左志剛;升血小板藥使用注意[N];醫(yī)藥養(yǎng)生保健報;2007年

10 記者 許琦敏;“鐵泵”蛋白幫助回收鐵元素[N];文匯報;2011年

相關博士學位論文 前10條

1 任翠平;IL-37調節(jié)巨噬細胞極化抑制宿主肝臟血吸蟲蟲卵肉芽腫和纖維化的機制研究[D];安徽醫(yī)科大學;2017年

2 周赤燕;巨噬細胞MsrA對動脈粥樣硬化的干預研究[D];武漢大學;2013年

3 章桂忠;TIPE2蛋白調控細胞增殖和炎癥的機制研究[D];山東大學;2015年

4 張瑜;DKK1抑制巨噬細胞內脂質沉積及其相關分子機制[D];山東大學;2015年

5 孟濤;異丙酚對心臟收縮功能的抑制作用及其對巨噬細胞分泌功能調節(jié)的機制研究[D];山東大學;2015年

6 周興;基于酵母微囊構建新型口服巨噬細胞靶向遞送系統(tǒng)的研究[D];第三軍醫(yī)大學;2015年

7 蔣興偉;Tim-3對巨噬細胞極化的調控機制研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2015年

8 劉伯玉;清道夫受體A介導小鼠巨噬細胞吞噬鉤端螺旋體研究[D];上海交通大學;2013年

9 楊紹俊;miRNA-155介導ESAT-6誘導巨噬細胞凋亡的分子機制及其在結核診斷中的作用[D];第三軍醫(yī)大學;2015年

10 翟光耀;單核/巨噬細胞Ly6C~(low)亞群在心肌梗死后瘢痕形成期的抗炎特性研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2014年

相關碩士學位論文 前10條

1 馬春梅;AP0E~(-/-)小鼠TLR9介導巨噬細胞極化效應對動脈粥樣硬化作用的研究[D];福建醫(yī)科大學;2015年

2 張譯丹;鹽皮質激素受體拮抗劑調控巨噬細胞表型對實驗性矽肺的作用[D];河北醫(yī)科大學;2015年

3 盧文冉;HCV core蛋白作用的巨噬細胞培養(yǎng)上清對肝細胞生物學性狀的影響[D];河北醫(yī)科大學;2015年

4 李文建;載脂蛋白E影響巨噬細胞因子表達及分型的機制研究[D];河北醫(yī)科大學;2015年

5 曹爽;高糖對巨噬細胞TLR4信號轉導的調節(jié)作用[D];河北醫(yī)科大學;2015年

6 寧程程;腫瘤相關巨噬細胞在子宮內膜癌雌激素敏感性中的作用及機制研究[D];復旦大學;2014年

7 高龍;PLD4在腫瘤相關巨噬細胞抑制結腸癌增殖中的作用研究[D];成都醫(yī)學院;2015年

8 任虹;感染期子宮頸癌U14細胞荷瘤小鼠抑制巨噬細胞CCL5分泌的機制研究[D];河北醫(yī)科大學;2015年

9 李美玲;雙酚A對小鼠腹腔巨噬細胞極化影響的體外研究[D];安徽醫(yī)科大學;2015年

10 劉瓊;黃芪多糖影響巨噬細胞向脂肪細胞趨化的作用及機制研究[D];新鄉(xiāng)醫(yī)學院;2015年

，

本文編號：1666307