本文關(guān)鍵詞： cry1Ah基因 cry1Ie基因 密碼子優(yōu)化 葉綠體定位 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位 農(nóng)桿菌介導(dǎo) 抗蟲(chóng)玉米 遺傳穩(wěn)定　出處：《東北農(nóng)業(yè)大學(xué)》2013年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：Bt cry1Ah基因是中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所張杰課題組從國(guó)內(nèi)蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）菌株BT8中分離克隆的一個(gè)新型殺蟲(chóng)蛋白基因。Cry1Ah基因與cry1Ac基因的氨基酸序列相似性最高，為82%。Cry1Ah蛋白對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)具有高毒力，對(duì)棉鈴蟲(chóng)、水稻二化螟的殺蟲(chóng)活性強(qiáng)于Cry1Ac蛋白；對(duì)亞洲玉米螟的殺蟲(chóng)活性強(qiáng)于Cry1Ac、Cry1Ab蛋白。Bt cry1Ie基因是張杰課題組從Bt菌株Btc007中分離克隆的另一個(gè)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的殺蟲(chóng)蛋白基因。Cry1Ie基因與cry1A類基因相似性很低，只有30%，并且它們之間無(wú)交互抗性。其編碼的蛋白對(duì)抗性和敏感玉米螟都有一定的毒力。將cry1Ah和cry1Ie基因同時(shí)構(gòu)建到一個(gè)表達(dá)載體中，能夠有效地克服基因種類單一、同源性高以及昆蟲(chóng)對(duì)Bt產(chǎn)生抗性等一系列問(wèn)題，同時(shí)也有望篩選到抗蟲(chóng)性能更高的轉(zhuǎn)基因作物。 對(duì)于一個(gè)來(lái)源于原核生物的基因，其編碼區(qū)序列所使用的密碼子通常在植物中使用的頻率較低，這會(huì)使外源基因在植物中僅有少量的積累。而將外源基因根據(jù)植物密碼子偏好進(jìn)行優(yōu)化后可以顯著地提高外源基因在植物中的表達(dá)。根據(jù)植物密碼子偏好性，本實(shí)驗(yàn)室早期工作對(duì)cry1Ah基因進(jìn)行過(guò)兩次改造以及對(duì)cry1Ie基因進(jìn)行過(guò)改造，本研究將cry1Ah基因進(jìn)行了第三次密碼子優(yōu)化。三次改造的cry1Ah基因(m1-cry1Ah，m2-cry1Ah，m3-cry1Ah)與原始cry1Ah基因進(jìn)行比對(duì)：GC含量由37%分別提高到48%，55%和63%。優(yōu)化后的cry1Ie基因(mcry1Ie)的GC含量提高到55%。 在轉(zhuǎn)基因作物研究中，提高轉(zhuǎn)基因表達(dá)的另一個(gè)主要策略是將外源蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位表達(dá)。亞細(xì)胞定位主要依賴于信號(hào)肽的作用，其中定位于葉綠體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的研究比較多也比較成功。本研究將m3-cry1Ah基因的N端連接一段來(lái)源于玉米R(shí)uBP羧化酶的葉綠體定位信號(hào)肽序列，，命名為CPT-m3-cry1Ah；另外將m3-cry1Ah基因的N端連接內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)肽，在C端連接內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)KDEL，命名為ER-m3-cry1Ah；將不連接任何信號(hào)肽的m3-cry1Ah基因命名為NK-m3-cry1Ah。依次構(gòu)建了三個(gè)植物表達(dá)載體pMhNK、pMhCTP和pMhER，并且都是以bar基因作為篩選標(biāo)記基因。 本研究首先利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將實(shí)驗(yàn)室保存的pMhGM (m1-cry1Ah)，pMAhb (m2-cry1Ah)以及本研究構(gòu)建的pMhNK (NK-m3-cry1Ah)，pMhCTP (CPT-m3-cry1Ah)共計(jì)四個(gè)植物表達(dá)載體進(jìn)行煙草轉(zhuǎn)化。通過(guò)對(duì)模式生物煙草的研究確定出最優(yōu)的cry1Ah基因密碼子使用形式以及研究蛋白葉綠體定位對(duì)基因表達(dá)的影響。一共侵染320個(gè)煙草葉片外植體，共獲得84株煙草再生苗，每個(gè)載體分別獲得21、28、20和15株。通過(guò)PCR檢測(cè)確定了每個(gè)載體的陽(yáng)性植株數(shù)分別為7、5、6和5株；通過(guò)Southern blot結(jié)果表明外源基因已整合到煙草基因組中；實(shí)時(shí)熒光定量PCR (quantitative RT-PCR，qRT-PCR)檢測(cè)結(jié)果表明pMhCTP煙草植株在四個(gè)載體的植株中表現(xiàn)出最高的轉(zhuǎn)錄水平，并且pMAhb、pMhNK和pMhCTP煙草植株的轉(zhuǎn)錄水平分別是pMhGM植株的4倍、9.5倍和12.5倍；ELISA檢測(cè)結(jié)果表明pMhCTP煙草植株中Cry1Ah蛋白表達(dá)量最高，并且pMAhb、pMhNK和pMhCTP煙草植株的Cry1Ah蛋白表達(dá)量分別是pMhGM植株的4倍、6倍和10倍；通過(guò)生物活性檢測(cè)結(jié)果表明喂食pMhGM、pMAhb、pMhNK和pMhCTP煙草葉片的棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)致死率分別為63%、82%、93%和100%，這四個(gè)載體煙草葉片對(duì)棉鈴蟲(chóng)的抗性等級(jí)分別為2.57、1.8、1.33和1級(jí)。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明cry1Ah基因的三次密碼子優(yōu)化和葉綠體定位表達(dá)逐步提高了cry1Ah基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)。 本研究隨后利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將七個(gè)植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化玉米自交系綜31幼胚進(jìn)行抗蟲(chóng)玉米的研究。這七個(gè)植物表達(dá)載體包括實(shí)驗(yàn)室保存的四個(gè)植物表達(dá)載體pMhGM (m1-cry1Ah)，pMAhb (m2-cry1Ah)，pMIeb (mcry1Ie)和pMAhIeb (含m2-cry1Ah和mcry1Ie)以及本研究構(gòu)建的三個(gè)植物表達(dá)載體pMhNK (NK-m3-cry1Ah)， pMhCTP (CPT-m3-cry1Ah)和pMhER(ER-m3-cry1Ah)。前期將植物表達(dá)載體pMhGM經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化玉米自交系綜31未成熟幼胚，一共轉(zhuǎn)化500個(gè)幼胚，共得到48株T0代玉米再生植株。PCR檢測(cè)表明有23株為PCR陽(yáng)性植株；然后通過(guò)各種分子檢測(cè)和生物活性檢測(cè)確定出兩個(gè)高抗蟲(chóng)玉米事件1-4和1-5；Southern blot檢測(cè)結(jié)果表明這兩個(gè)高抗蟲(chóng)玉米事件中的外源基因均以單拷貝形式插入玉米基因組中；通過(guò)對(duì)這兩個(gè)抗蟲(chóng)事件的T1~T6代植株的Cry1Ah蛋白的表達(dá)和遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行研究，結(jié)果表明Cry1Ah蛋白在每一代的玉米植株中都能正常穩(wěn)定的表達(dá)，并且植株在田間對(duì)玉米螟的抗性也是穩(wěn)定遺傳的。隨后我們將以上七個(gè)植物表達(dá)載體對(duì)玉米自交系綜31幼胚進(jìn)行大規(guī)模轉(zhuǎn)化，一共轉(zhuǎn)化20070個(gè)玉米未成熟幼胚，獲得7745塊抗性愈傷，共得到T0代玉米轉(zhuǎn)化植株1764株。通過(guò)PCR檢測(cè)確定1360株為PCR陽(yáng)性植株；然后通過(guò)分子檢測(cè)和生物活性檢測(cè)確定了轉(zhuǎn)cry1Ah單基因以及轉(zhuǎn)cry1Ah和cry1Ie雙基因的抗蟲(chóng)玉米事件數(shù)分別是29個(gè)和14個(gè)，其中表現(xiàn)為高抗蟲(chóng)的玉米事件數(shù)分別為8個(gè)和3個(gè)；通過(guò)對(duì)這43個(gè)抗蟲(chóng)事件的T1~T2代植株的Cry1Ah蛋白的表達(dá)和遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行研究，結(jié)果表明Cry1Ah蛋白在T1~T2代的玉米植株中都能正常穩(wěn)定的表達(dá)，并且植株在田間對(duì)玉米螟的抗性也是穩(wěn)定遺傳的。獲得的抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因玉米材料具有很好的應(yīng)用價(jià)值，可以作為候選材料進(jìn)行下一步Bt抗蟲(chóng)玉米的育種工作。 此外，我們對(duì)抗蟲(chóng)性表現(xiàn)非常突出的兩個(gè)雙基因抗蟲(chóng)玉米事件pMAhIeb60和pMAhIeb186的T2代植株的苞葉、葉片和花絲進(jìn)行了Cry1Ah蛋白量的分析，結(jié)果表明事件pMAhIeb60的植株中Cry1Ah蛋白表達(dá)量都比較高，由高到低的表達(dá)部位分別是苞葉、葉片和花絲，每鮮克重表達(dá)Cry1Ah蛋白量分別是4.5μg/g fresh weight (f.w.)、3.5μg/g (f.w)和2.5μg/g(f.w)；事件pMAhIeb186植株的苞葉、葉片中表達(dá)Cry1Ah蛋白量較高，都為3.5μg/g (f.w)，而花絲中表達(dá)量為0.8μg/g (f.w)。Cry1Ah蛋白在葉片中的高表達(dá)可以有效防治玉米螟初期危害，而在苞葉和花絲中的高表達(dá)可以有效防治玉米螟后期危害，這兩個(gè)高抗蟲(chóng)事件有望走向產(chǎn)業(yè)化。
[Abstract]:The Bt cry1Ah gene is a novel insecticidal protein gene isolated from Bacillus thuringiensis ( Bt ) strain BT8 . Cry1Ah gene has a high virulence to cry1Ac gene . The insecticidal activity of Cry1Ah gene to cry1Ac gene is very low , and the insecticidal activity of Cry1Ah protein is stronger than Cry1Ac and Cry1Ab protein . According to plant codon preference , the cry1Ah gene ( m1 - cry1Ah , m2 - cry1Ah , m3 - cry1Ah ) and the original cry1Ah gene were optimized . The expression of cry1Ah gene was increased from 37 % to 48 % , 55 % and 63 % respectively . In the research of transgenic crops , it is another important strategy to improve the expression of transgenes . Subcellular localization mainly depends on the function of signal peptide , which is located in chloroplast and endoplasmic reticulum . The N - terminal of m3 - cry1Ah gene is connected to the chloroplast localization signal peptide sequence derived from corn RuBP Carboxylase , named as CPT - m3 - cry1Ah . Three plant expression vectors pMhNK , pMhCTP and pMhER are constructed in this order , and all the three plant expression vectors pMhNK , pMhCTP and pMhER are constructed . The results showed that the expression of Cry1Ah protein in pMhGM , pMAhb , pMhNK and pMhCTP tobacco plants was 4 - fold , 9.5 - fold and 12.5 - fold higher than that of pMhGM plants . The results showed that the three - codon optimization and chloroplast localization of pMhGM , pMAhb , pMhNK and pMhCTP tobacco plants were respectively 2.57 , 1.8 , 1.33 and 1 . The expression and genetic stability of Cry1Ah protein in maize inbred lines were studied by means of molecular detection and bioassay . The results showed that the Cry1Ah protein was stably expressed in maize plants in each generation . The expression of Cry1Ah protein in leaves and leaves of pMAhIeb60 was 4.5 渭g / g fresh weight ( f . w . ) , 3.5 渭g / g ( f . w ) and 2.5 渭g / g ( f . w ) respectively .

【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：Q943.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1526527