本文關(guān)鍵詞： 中國甜柿 單寧凝固 乙醇脫氫酶 丙酮酸脫羧酶 瞬時轉(zhuǎn)化　出處：《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：中國原產(chǎn)完全甜柿(簡稱“中國甜柿”或CPCNA)自然脫澀性狀受顯性基因控制,而日本原產(chǎn)完全甜柿(簡稱“日本甜柿”或JPCNA)受隱性基因控制,因而中國甜柿較日本甜柿具有更重要的育種價值。中國甜柿自然脫澀機理明顯有別于僅依靠“稀釋效應(yīng)”的日本甜柿,除“稀釋效應(yīng)”外可能還涉及單寧的“凝固效應(yīng)”,即可溶性單寧與乙醛反應(yīng)轉(zhuǎn)變成不溶性單寧的過程。本研究以中國甜柿為試材,以非完全甜柿(non-PCNA)和日本甜柿為對照,首先從中國甜柿中分離參與乙醛代謝的兩個關(guān)鍵酶基因:乙醇脫氫酶基因(ADH)和丙酮酸脫羧酶基因(PDC);進而通過分析其在不同脫澀類型(中國甜柿、日本甜柿和非完全甜柿)、不同發(fā)育階段(花后5、10、15、20和25周)、不同部位(花、葉片、萼片、果皮、果肉、果心和種子)表達模式差異并結(jié)合單寧含量及乙醇和乙醛含量分析,篩選與中國甜柿可溶性單寧的自然凝固直接有關(guān)的目標(biāo)基因;此外,通過構(gòu)建瞬時轉(zhuǎn)化體系,進一步確認(rèn)候選目標(biāo)基因的功能,以期從分子水平解析中國甜柿自然脫澀機理。主要研究結(jié)果如下:1.以GFP作為報告基因,基于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的注射滲透法,建立適宜栽培柿基因功能驗證的活體葉片瞬時超表達體系。通過乙酰丁香酮濃度、菌液濃度和注射后不同采樣時間對瞬時轉(zhuǎn)化條件進行了優(yōu)化,且該體系適用于不同脫澀類型柿品種‘磨盤柿’(non-PCNA)、‘鄂柿1號’(CPCNA)和‘寶蓋甜柿’(CPCNA)。將DkLAC1瞬時轉(zhuǎn)化‘磨盤柿’和‘鄂柿1號’葉片,發(fā)現(xiàn)DkLAC1表達導(dǎo)致兩個柿品種葉片原花青素含量升高。2.基于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的注射滲透法,建立ihpRNA(發(fā)夾RNA)誘導(dǎo)的柿活體葉片基因瞬時沉默技術(shù)。DkPDS被選擇作為內(nèi)源報告基因,用于評價該瞬時沉默體系。利用該技術(shù)將pHG-LAR(DkLAR基因ihpRNA干涉載體)瞬時轉(zhuǎn)化‘磨盤柿’、‘鄂柿1號’和‘陽豐’活體葉片,利用DMACA染色及Folin-Ciocalteau法測定原花青素含量,結(jié)果顯示DkLAR瞬時沉默均導(dǎo)致柿葉片原花青素含量顯著降低,表明DkLAR參與柿原花青素的生物合成。3.基于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真空滲透法,建立柿組培苗瞬時轉(zhuǎn)化體系。在真空滲透20min條件下GUS基因瞬時轉(zhuǎn)化效率最高。利用該技術(shù)將pHG-LAR(DkLAR基因ihpRNA干涉載體)瞬時轉(zhuǎn)化‘小果甜柿’和‘磨盤柿’組培苗,利用DMACA染色及Folin-Ciocalteau法測定原花青素含量,結(jié)果顯示DkLAR瞬時沉默導(dǎo)致兩個柿品種組培苗葉片原花青素含量顯著降低。進一步證實DkLAR在柿原花青素生物合成中具有重要的作用。4.中國甜柿可溶性單寧累積持續(xù)到果實發(fā)育后期。在花后20-25周(WAF),其可溶性單寧含量迅速降低并完成自然脫澀過程,且不溶性單寧含量在果實發(fā)育后期(15-25 WAF)快速上升,表明中國甜柿自然脫澀可能涉及可溶性單寧的凝固。非完全甜柿果實直至成熟期其可溶性單寧含量仍維持較高水平。日本甜柿在果實早期(10 WAF前)停止可溶性單寧的累積,并通過“稀釋效應(yīng)”完成自然脫澀過程。5.從中國甜柿中分離3個ADH基因家族成員(DkADH1、DkADH2和DkADH3)和4個PDC基因家族成員(DkPDC1、DkPDC2、DkPDC3和DkPDC4)。其中DkADH1、DkADH2、DkADH3、DkPDC2和DkPDC3均獲得cDNA全長序列,其ORF序列分別為1140 bp、1137 bp、1044 bp、1824 bp和1743 bp。6.ADH和PDC時空表達分析結(jié)果顯示,在中國甜柿果實發(fā)育后期,即不溶性單寧含量快速上升期間(15-25 WAF),DkADH1、DkPDC1和DkPDC2特異性上調(diào)表達;且在種子中ADH和PDC高量表達,尤其是DkADH1、DkPDC1和DkPDC2。這表明DkADH1、DkPDC1和DkPDC2可能與中國甜柿單寧凝固具有密切的關(guān)系。7.不同發(fā)育時期果肉和種子乙醇和乙醛含量測定的結(jié)果表明,種子中乙醇和乙醛含量均高于果肉。中國甜柿和日本甜柿種子乙醛含量隨果實發(fā)育不斷升高,乙醇含量在果實發(fā)育早期較高,而后隨果實發(fā)育不斷降低。尤其在果實發(fā)育后期(20-25WAF),中國甜柿種子乙醛含量快速上升,與其不溶性單寧含量變化趨勢一致。果肉中乙醇含量均隨果實發(fā)育而不斷降低。中國甜柿和非完全甜柿果肉乙醛含量也隨果實發(fā)育不斷降低,而日本甜柿與之相反。8.采用‘磨盤柿’葉片的瞬時遺傳轉(zhuǎn)化試驗結(jié)果顯示,DkADH1和DkPDC2超表達均能顯著降低葉片可溶性單寧含量。綜上所述,基于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的注射滲透和真空滲透法,本研究建立了柿活體葉片和組培苗的瞬時轉(zhuǎn)化體系。研究結(jié)果認(rèn)為,中國甜柿自然脫澀主要涉及單寧的“凝固效應(yīng)”,且DkADH1、DkPDC1和DkPDC2在其自然脫澀過程中起關(guān)鍵作用。該研究結(jié)果為闡明中國甜柿自然脫澀特點提供了新的科學(xué)依據(jù),并為選育具自主知識產(chǎn)權(quán)中國甜柿新種質(zhì)奠定基因資源和技術(shù)基礎(chǔ)。
[Abstract]:In this study , two key enzymes genes : alcohol dehydrogenase gene ( ADH ) and pyruvate decarboxylase gene ( PDC ) were isolated from Chinese sweet persimmon . The results showed that DkADH1 , DkPDC1 and DkPDC2 could significantly decrease the content of soluble tannin . The results showed that DkADH1 , DkPDC1 and DkPDC2 could significantly decrease the content of soluble tannin .

【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S665.2

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