發(fā)布時間：2020-05-09 17:26

【摘要】：生物胺(Biogenic amine,BA)是一類具有生物活性的低分子量含氮有機化合物的總稱,廣泛存在于富含蛋白質和氨基酸的水產品中。大黃魚(Pseudosciaena crocea)作為我國重要的經濟魚類之一,國內市場需求量不斷增長,但由于其富含水分和多種可溶性蛋白,極易在貯藏、加工及流通過程中滋生微生物進而分解魚體內含氮物質產生大量生物胺,導致產品腐敗,造成極大的經濟損失、資源浪費和環(huán)境污染。目前有關大黃魚中生物胺的產生特性及其消長機理尚未明確,因此本實驗開展由特定腐敗微生物介導的冷藏大黃魚主要生物胺形成機制的探究和解析,旨在為有效進行大黃魚品質變化監(jiān)控和腐敗靶向抑制提供一定的理論基礎和保障。主要研究內容包含以下四個方面:(1)本課題動態(tài)檢測了養(yǎng)殖大黃魚冷藏過程中的生物胺含量、菌落總數、典型理化指標(pH、TVB-N、TMA、P.I.%)及游離氨基酸含量變化,分析發(fā)現腐胺和尸胺是大黃魚的主要生物胺,且兩者含量之和可取代生物胺指標(BAI = Put + Cad + Him + Tym)來更快更直接地評估大黃魚的新鮮度;我們進一步通過構建腐胺和尸胺與理化指標的回歸模型(RPut = 0.88,P0.05;RCad = 0.87,P0.05)解析了兩者較強的致腐特性;而生物胺與其前體物質游離氨基酸的動態(tài)相關性分析初步預示了腐胺形成的相對復雜性。(2)本課題組前期鑒定得到大黃魚中致腐能力較強的特定腐敗菌S.baltica 73,基于前一章實驗結果,本實驗開展S.baltica 73中腐胺形成通路的探究。根據已有的腐胺代謝通路研究報道,經過同源序列比對及PCR驗證,我們在S.baltica 73中鑒定得到11個編碼腐胺通路代謝酶的基因,分別為ARG、ADC、AgDI、OCT、odc、speF、pptE、TF、TG、TH和PotI;進而圍繞鳥氨酸脫羧酶這一關鍵限速酶所在的中心代謝通路(ODC體系),探究關鍵代謝物鳥氨酸和腐胺對該體系的誘導作用;并分別構建了AspeF和△potE缺失株,結合基因表達量檢測和腐胺產量的動態(tài)監(jiān)測,探究ODC體系的運作機制,解析了speF和potE基因在腐胺產生中的關鍵主導作用,并提出了S.baltica 73中“PUT正向調控”的腐胺積累模式。(3)基于ODC體系探索環(huán)境pH對S.baltica 73腐胺積累的誘導調節(jié)作用。通過5個不同pH(5.5,6.0,6.5,7.0,7.5)培養(yǎng)環(huán)境刺激,我們探究了不同環(huán)境pH誘導對S.baLTICA 73 ODC體系相關基因表達、胞內speF蛋白酶活性大小以及菌體產腐胺能力的影響。實驗結果表明pH為5.5、6.0、6.5的酸性環(huán)境對speF與potE基因具有較強的誘導表達作用并在6.0時最為顯著;5個不同培養(yǎng)條件下細胞內speF蛋白酶活性大小依次為6.06.57.05.57.5;相應的菌體產腐胺量分別為 536.74mg/L(pH = 5.5),679.16mg/L(pH = 6.0),604.25 mg/L(pH = 6.5),538.54 mg/L(pH = 7.0),340.91 mg/L(pH= 7.5);由此揭示了 S.balticA 73中弱酸環(huán)境(pH=6.0/6.5)誘導腐胺大量產生的機理。(4)從蛋白層面考慮,本實驗利用親和免疫富集結合質譜鑒定技術,檢測了s.baltica73的乙�；揎椝�,鑒定到1103個乙�；揎椀鞍缀�2929個乙�；稽c;進一步的生物信息學分析顯示乙�；鞍讌⑴c多種代謝通路,且搜尋驗證了 ADC、OCT、speF這三個腐胺通路代謝酶都具有乙�；揎椢稽c,推測該修飾可能對腐胺產生及積累具有一定調節(jié)作用;通過構建高保守性乙酰轉移酶和去乙�；傅幕蛉笔е�,我們初步探究了乙�；揎椝脚c腐胺產量的關系,對比結果分析發(fā)現乙�；揎棌姸扰c腐胺含量存在一定負相關性。綜上所述,本課題研究結果表明冷藏大黃魚主要生物胺為腐胺和尸胺,兩者含量之和可評估魚體鮮度;且以大黃魚特定腐敗菌S.baltica73為切入點,通過進一步探究其腐胺形成機理,闡述了菌體內“PUT正向調控”腐胺積累的運作機制;同時也揭示并解析了弱酸性環(huán)境誘導S.baltica 73腐胺大量產生的作用機理;最后S.baltica 73乙�；揎椊M學的初探也表明了乙�；揎椝脚c腐胺積累程度潛在的負向關聯性。以上研究結果為水產品腐胺控制關鍵靶點的確定以及產品保鮮都提供了一定借鑒意義。
【圖文】：

于４°Ｃ下靜置６０１１！丨１１以去除脂肪及提取待測物質，離心（ｉｎ，４°Ｃ）過濾，重復提取沉淀兩次，合并濾液并定容至５０ｍＬ。行高速離心（１３，０００Ｘｇ，１５ｍｉｎ，，４°Ｃ），上清液過０．２２ｎｍＰＶ動氨基酸分析儀進行檢測分析。逡逑曲線制備：氨基酸混合標準品用０．１邋ＭＨＣＬ配制成１００邋｜ｉＭ溶測分析。逡逑據處理與分析逡逑重復六次，結果用平均值±標準偏差表示，數據統計分析用ＳＰＳＳ邋ｖ性分析、方差分析、顯著性分析及回歸分析，以Ｐ＜0．0５作為差采用Ｐｒｉｓｍ邋７．０繪畫軟件作圖。逡逑與分析逡逑殖大黃魚冷藏條件下ＴＶＣ變化情況逡逑

魚體ｐＨ會有略微下降，但隨著自身酶解作用以及微生物作用的加強，大量蛋白逡逑質發(fā)生降解產生各類含氮揮發(fā)性物質，致使ｐＨ逐漸上升。逡逑分析圖２－２知，揮發(fā)性鹽基氮在貯藏期間發(fā)生顯著變化，在貯藏末期己經高逡逑達４０ｍｇ／１００ｇ。根據ＳＣ／Ｔ３１０１－２０１０《鮮大黃魚、凍大黃魚、鮮小黃魚、凍小黃逡逑魚》規(guī)定，大黃魚一級鮮度標準為ＴＶＢ－Ｎ邋￡邋１３邋ｍｇ／１００ｇ，二級標準為ＴＶＢ－Ｎ邋Ｓ逡逑３０ｍｇ／１００ｇ，由此可知冷藏大黃魚在第４天（ｌ３．１５ｍｇＭ００ｇ）己超出一級鮮度范逡逑圍，在１Ｃ藏丨２天（３０ｍｇ／１００ｇ）時超達二級標準，徹底腐敗變質。同樣地，ＴＭＡ逡逑含量也在貯藏期間不斷顯著增加，從最初的１邋ｍｇ／１００ｇ到最后的１４２邋ｍｇ／１００ｇ，逡逑由此可見胺類物質隨著貯藏時間的延長大量增多導致魚體腐敗，魚腥味也明顯增逡逑強。Ｐ．Ｉ．％為非蛋白氮在總氮中所占的百分比
【學位授予單位】：浙江工商大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：TS254.4

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本文編號：2656482