本文關(guān)鍵詞：慢性嗎啡作用誘導(dǎo)大鼠原代海馬神經(jīng)元損傷及其機(jī)制研究

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【摘要】：目的:嗎啡(Morphine,Mor),作為極其重要的阿片類毒品,因具有很強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用在臨床長期使用,但是嗎啡使用后會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的欣快感,進(jìn)而造成嗎啡依賴,并出現(xiàn)精神、認(rèn)知功能障礙,行為不受自主控制等。海馬(Hippocampus,Hip)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一個(gè)重要腦區(qū),參與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展過程。以海馬為研究對象探索毒品成癮和損傷機(jī)制是重要的手段。研究發(fā)現(xiàn),慢性嗎啡處理造成大鼠海馬神經(jīng)元樹突棘萎縮、消失,導(dǎo)致海馬區(qū)δ阿片受體細(xì)胞重新分布,并減少δ阿片受體細(xì)胞的密度,這可能是改變海馬生理功能,造成長時(shí)間認(rèn)知障礙的重要原因。細(xì)胞凋亡(Apoptosis)是以細(xì)胞DNA發(fā)生特異性的降解,形態(tài)上表現(xiàn)為核固縮、胞膜發(fā)泡和凋亡小體形成為特征,是由特定的基因調(diào)控,無明顯細(xì)胞溶解的過程。目前普遍認(rèn)為細(xì)胞凋亡的通路有三種:線粒體通路、死亡受體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路,其中前兩者是經(jīng)典的凋亡通路,后者是近些年發(fā)現(xiàn)的一種凋亡通路。線粒體膜電位的降低是細(xì)胞發(fā)生凋亡早期的重要標(biāo)志,TUNEL法則能反映細(xì)胞凋亡典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征,Annexin V被公認(rèn)為檢測細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一,而caspase-3在凋亡信號傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮重要的功能。通過上述指標(biāo)的檢測,可以反映細(xì)胞發(fā)生凋亡的情況。大量研究表明,長期嗎啡作用可造成神經(jīng)系統(tǒng)損傷,且因嗎啡攝入方式、劑量、時(shí)間和腦區(qū)不同而產(chǎn)生不同程度的損傷。Bajic等在給出生1天的大鼠連續(xù)注射6天半嗎啡后,通過檢測caspase-3水平發(fā)現(xiàn),皮層和杏仁核有明顯的神經(jīng)元凋亡。本科室以往對嗎啡誘導(dǎo)的依賴、損傷及機(jī)制進(jìn)行了系列研究。谷建平等采取放射免疫分析法對嗎啡依賴大鼠各腦區(qū)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)和環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)含量進(jìn)行測定,發(fā)現(xiàn)紋狀體、間腦、中腦、腦橋和海馬內(nèi)cAMP含量明顯升高,而(cGMP)含量明顯下降,這表明cAMP和cGMP信號系統(tǒng)變化在嗎啡依賴中起著重要作用。另有研究發(fā)現(xiàn),大鼠在給予嗎啡后,腦橋谷氨酸(Glu)含量明顯升高,而中腦、海馬、間腦和紋狀體則未見明顯變化,腦橋、中腦、間腦和紋狀體γ-氨基丁酸(GABA)含量明顯升高。史為博等發(fā)現(xiàn),經(jīng)過嗎啡長期處理,大鼠中腦腹側(cè)背蓋區(qū)和黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)變性壞死,表明嗎啡產(chǎn)生毒性作用。此外,采用MTT法檢測到嗎啡能夠劑量依賴性地降低SH-SY5Y細(xì)胞和PC12細(xì)胞的生存率,并檢測到半數(shù)抑制率分別為2520μmol/L和680μmol/L,鏡下觀察到細(xì)胞突觸變短或消失,細(xì)胞原有形態(tài)喪失�；谏鲜鲅芯勘尘�,本實(shí)驗(yàn)在成功培養(yǎng)大鼠原代海馬神經(jīng)元后,進(jìn)行神經(jīng)元鑒定,并通過MTT法確定合適的嗎啡濃度,以及采取TUNEL法、流式細(xì)胞術(shù)法、線粒體膜電位檢測(JC-1)法、蛋白免疫印跡法等方法,觀察慢性嗎啡作用誘導(dǎo)的大鼠原代海馬神經(jīng)元凋亡情況,以及對神經(jīng)元凋亡的產(chǎn)生機(jī)制進(jìn)行分析。方法:1本實(shí)驗(yàn)取材于新生24h以內(nèi)的SD乳鼠,進(jìn)行大鼠原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)。2采用免疫熒光法進(jìn)行神經(jīng)元鑒定,并用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。3采用MTT法檢測嗎啡與大鼠原代海馬神經(jīng)元生存率之間時(shí)效和量效關(guān)系,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇合適的嗎啡濃度。4采用TUNEL法觀察嗎啡作用下大鼠原代海馬神經(jīng)元的變化,并計(jì)算各組凋亡率。5采用流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)染色法檢測各組細(xì)胞凋亡率。6采用線粒體膜電位檢測方法,觀察嗎啡作用下原代海馬神經(jīng)元線粒體膜電位變化情況。7采用蛋白免疫印跡法檢測Bax、caspase-3蛋白表達(dá)水平。以上所得數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,各組均數(shù)行單因素方差分析(one-way ANOVA),以Tamhane's T2作兩兩比較,以p0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1大鼠原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)結(jié)果成熟的原代海馬神經(jīng)元,突觸伸長且較粗并出現(xiàn)分支,交織成網(wǎng),胞體呈錐形、橢圓形或三角形且豐滿,周圍光圈明顯,少數(shù)神經(jīng)元出現(xiàn)聚團(tuán)生長現(xiàn)象。2免疫熒光法進(jìn)行神經(jīng)元鑒定結(jié)果采用免疫熒光法對培養(yǎng)成熟的原代海馬神經(jīng)元進(jìn)行鑒定,以微管相關(guān)蛋白2(MAP2)為一抗,Tritc標(biāo)記的二抗染色,DAPI復(fù)染,激光共聚焦顯微鏡下觀察到神經(jīng)元核為藍(lán)色且體積較大,突觸為紅色且交織成網(wǎng)狀,立體感強(qiáng)。3MTT法檢測細(xì)胞生長抑制率結(jié)果相較于對照組,Mor(0.156mM~1.25mM)作用于大鼠原代海馬神經(jīng)元6h、12h、24h、48h后,神經(jīng)元生長抑制率無明顯變化,光鏡下觀察神經(jīng)元形態(tài)亦無明顯變化;相較于對照組,Mor(2.5mM~10mM)作用于大鼠原代海馬神經(jīng)元24h、48h時(shí),Mor5mM作用于大鼠原代海馬神經(jīng)元12h時(shí),Mor10mM作用于大鼠原代海馬神經(jīng)元6h、12h時(shí),神經(jīng)元生長抑制率明顯升高,且隨嗎啡濃度升高而愈加升高,并呈時(shí)間依賴性,光鏡下可觀察到神經(jīng)元空泡樣結(jié)構(gòu)甚至破裂,突觸變短或消失,神經(jīng)元形態(tài)喪失。4TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡率結(jié)果與對照組相比,1mM、2mM、3mM嗎啡作用于大鼠原代海馬神經(jīng)元48h后,神經(jīng)元凋亡率明顯升高,且呈濃度依賴性,并且可以觀察到TUNEL陽性數(shù)目隨著嗎啡濃度的升高而升高。5流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)染色法檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果相較于對照組,Mor1mM、Mor2mM、Mor3mM組神經(jīng)元總凋亡率明顯升高,且以早期凋亡增加為主,并呈濃度依賴性。6線粒體膜電位檢測(JC-1)法結(jié)果與對照組相比,Mor1mM、Mor2mM、Mor3mM組紅色熒光強(qiáng)度隨濃度升高而逐漸下降,綠色熒光強(qiáng)度隨濃度升高而逐漸增加,表明線粒體膜電位下降,發(fā)生早期凋亡。7Western Blot檢測Bax、caspase-3的表達(dá)結(jié)果與對照組相比,Mor1mM、Mor2mM、Mor3mM組原代海馬神經(jīng)元Bax、caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯升高,且呈濃度依賴性,提示神經(jīng)元凋亡與Bax、caspase-3蛋白表達(dá)水平升高有關(guān)。結(jié)論:1、低濃度的嗎啡可促進(jìn)大鼠原代海馬神經(jīng)元的生長,而高濃度的嗎啡則抑制大鼠原代海馬神經(jīng)元的生長。2、高濃度的嗎啡作用可使培養(yǎng)的大鼠原代海馬神經(jīng)元發(fā)生變性壞死和凋亡,Bax表達(dá)增加和caspase-3的活化可能是引起的大鼠原代海馬神經(jīng)元凋亡的分子機(jī)制之一。
【關(guān)鍵詞】：嗎啡 原代培養(yǎng) 海馬 神經(jīng)損傷 神經(jīng)毒性 細(xì)胞凋亡
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：D919
【目錄】：

• 摘要4-8
• ABSTRACT8-13
• 英文縮寫13-14
• 前言14-17
• 材料與方法17-27
• 結(jié)果27-30
• 附圖30-39
• 附表39-41
• 討論41-54
• 結(jié)論54-55
• 參考文獻(xiàn)55-63
• 綜述 傳統(tǒng)毒品、新型毒品對中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷作用研究63-82
• 參考文獻(xiàn)72-82
• 致謝82-83
• 個(gè)人簡歷83

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王建材;馮達(dá)云;李洋;王寶;楊倩;高國棟;;DKK1對慢性嗎啡和納洛酮處理的培養(yǎng)海馬神經(jīng)元樹突棘的影響[J];神經(jīng)解剖學(xué)雜志;2016年01期

2 王雁;湯納平;惠濤濤;富欣;李華;楊琛懋;周國民;馬t，

本文編號：925448