本文關(guān)鍵詞：胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白5（IGFBP5）調(diào)節(jié)甲基苯丙胺誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元凋亡，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景和目的： 伴隨著新型毒品的不斷增多,毒品濫用已然成為全球各個(gè)國家共同面臨的嚴(yán)峻社會(huì)問題,我國的吸毒問題也日趨嚴(yán)重,吸毒者為了籌集毒資,以身試法,參與的刑事犯罪案件逐年遞增,毒品本身可以引起精神損害,導(dǎo)致暴力傷害、自殺、他殺行為增加,成癮者勞動(dòng)能力喪失,吸毒相關(guān)的猝死和戒斷性死亡時(shí)有發(fā)生,不僅增加社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和社會(huì)穩(wěn)定性風(fēng)險(xiǎn),而且嚴(yán)重傷害人體的身體健康和精神健康。成為國際上共同關(guān)注的嚴(yán)重社會(huì)問題,也是醫(yī)學(xué)屆包括法醫(yī)學(xué)界越來越關(guān)注的重點(diǎn)研究問題。 甲基苯丙胺(Methamphetamine, METH),俗稱冰毒,隸屬苯丙胺類興奮劑,是化學(xué)合成的一種新型毒品。METH不但具有很強(qiáng)的中樞興奮作用,吸食后可導(dǎo)致刻板行為、致幻、食欲減退和交感能效應(yīng)等藥理、毒理學(xué)特性,而且易形成藥物依賴性,甚至可以一次成癮,劑量大時(shí)可出現(xiàn)急性中毒甚至直接導(dǎo)致猝死,。對于長期使用METH者而言,其不但會(huì)引起精神行為學(xué)上的改變,還會(huì)引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的結(jié)構(gòu)和功能的損傷性改變。近年來臨床和動(dòng)物模型研究表明,METH可通過各種途徑引起額葉皮質(zhì)、紋狀體及海馬等區(qū)域內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的壞死和凋亡,而METH'慢性使用者大腦實(shí)質(zhì)內(nèi)會(huì)出現(xiàn)與帕金森病(Parkinson's disease,PD)等神經(jīng)退行性疾病類似的病理學(xué)改變,這可能與METH的神經(jīng)毒理作用有關(guān),比如多巴胺(Dopamine, DA)耗竭及其受體數(shù)量減少、氧化應(yīng)激(Oxidative Stress, OS)損傷、體溫調(diào)節(jié)失衡導(dǎo)致機(jī)體高熱、炎癥損傷,以及細(xì)胞凋亡相關(guān)通路的激活等,最終導(dǎo)致相關(guān)腦區(qū)和類型的神經(jīng)元受損而出現(xiàn)退行性病變。但目前的研究結(jié)果尚不足以系統(tǒng)、完善的闡明METH的神經(jīng)毒性機(jī)制,有待進(jìn)一步深入的研究。 胰島素樣生長因子(Insulin-like Growth factor, IGF)軸是一類在分子水平調(diào)節(jié)著細(xì)胞的生長、分化和凋亡的多肽,包括IGFs(IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ)、IGF受體(IGFR). IGF結(jié)合蛋白(IGFBP1～7),共同構(gòu)成IGF系統(tǒng)。IGFBPs可以調(diào)節(jié)IGFs軸的活性并具有細(xì)胞和組織特異性。IGFBP5作為IGFBP5的重要成員之一,也發(fā)揮著調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化及凋亡的重要作用。目前許多的的研究已經(jīng)證明IGFBP5在嚙齒類動(dòng)物的腦組織發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用。例如,Zhong等學(xué)者在研究中發(fā)現(xiàn)：如果將IGFBP5的抗體添加到顆粒神經(jīng)元的培養(yǎng)基中,則細(xì)胞的存活率顯著增強(qiáng)；如果加入IGFBP5至培養(yǎng)基中則實(shí)驗(yàn)結(jié)果剛好相反。因此,他們認(rèn)為IGFBP5的過表達(dá)很有可能誘導(dǎo)了顆粒神經(jīng)元的早期凋亡。Marshman等人研究發(fā)現(xiàn)在離體的小鼠乳腺上皮細(xì)胞中加入外源性的IGFBP5or IGFBP3可以抑制IGF-I調(diào)節(jié)細(xì)胞存活的作用,直接導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡率達(dá)3倍以上。隨后,Butt等人發(fā)現(xiàn)IGFBP5可以激活MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的中的caspase-8和caspase-9,進(jìn)而通過凋亡通路中的BCL-2機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這些發(fā)現(xiàn)都與IGFBP5可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡這一效應(yīng)是一致的。 本課題組多年來致力于METH的神經(jīng)毒性研究,我們在前一階段的研究中發(fā)現(xiàn),對METH注射后的大鼠紋狀體等部位檢測發(fā)現(xiàn)多巴胺能神經(jīng)元的凋亡增加,PC12細(xì)胞(多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞株)用METH處理后得到相對應(yīng)的結(jié)果,并且發(fā)現(xiàn)METH處理后的PC12細(xì)胞在24小時(shí)內(nèi)IGFBP5顯著升高,但I(xiàn)GFBP5是否參與調(diào)節(jié)METH誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元凋亡,如果參與,其作用機(jī)制為何等一系列問題并未得到確切答案。于是,本文立足以上研究基礎(chǔ),擬解決IGFBP5是否參與調(diào)節(jié)METH誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡及調(diào)節(jié)機(jī)制等問題,為METH成癮者的治療提供新的思路和有效的藥物作用靶點(diǎn)。 研究內(nèi)容及方法： 一. IGFBP5在METH處理的大鼠腦組織標(biāo)本和PC12細(xì)胞株中的表達(dá)情況 1.采用全基因組芯片技術(shù)檢測大鼠所有基因在METH毒性損傷的PC12細(xì)胞中的表達(dá),初步確定所有基因的表達(dá)水平的變化,以期篩選出差異表達(dá)的mRNA。 2.采用Real Time PCR(熒光定量PCR)手段驗(yàn)證基因芯片中檢測出的IGFBP4、IGFBP5、IGFBP7mRNA水平的表達(dá)。用METH對PC12細(xì)胞進(jìn)行處理,檢測基因芯片中信號(hào)增強(qiáng)的IGFBP4、IGFBP5、IGFBP7mRNA的特異性表達(dá)情況。 3.建立急性METH中毒大鼠模型,選取大鼠紋狀體,采用熒光定量PCR手段驗(yàn)證IGFBP4、IGFBP5、IGFBP7mRNA在大鼠組織標(biāo)本中的特異性表達(dá)情況。 4.采用熒光定量PCR手段檢測不同濃度METH處理PC12細(xì)胞相同時(shí)間以及同一濃度METH處理PC12細(xì)胞不同時(shí)間的情況下IGFBP5mRNA表達(dá)情況。同時(shí)采用Westen Blot方法IGFBP5蛋白表達(dá)情況,確定METH濃度和處理時(shí)間對IGFBP5的影響。 二.IGFBP5基因沉默的PC12細(xì)胞在METH誘導(dǎo)下IGFBP5的表達(dá)及細(xì)胞的凋亡情況 1.針對IGFBP5基因設(shè)計(jì)并合成三條siRNA干擾序列,采用RNA干擾技術(shù)(RNAi)處理PC12細(xì)胞,采用熒光定量PCR方法檢測出有效干擾序列。 2.采用有效干擾序列沉默PC12細(xì)胞的IGFBP5mRNA表達(dá)后,用METH進(jìn)行處理,采用Westen Blot方法IGFBP5蛋白表達(dá)情況,確定IGFBP5的表達(dá)上升在METH的毒性損傷過程中是否為伴隨現(xiàn)象。 3.采用TUNEL法檢測IGFBP5基因沉默的PC12細(xì)胞經(jīng)METH處理后的細(xì)胞凋亡情況。 三.初步探測IGFBP5在調(diào)節(jié)METH誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用中的分子機(jī)制 1.采用Westen Blot方法檢測IGFBP5基因沉默的PC12細(xì)胞經(jīng)METH處理后s細(xì)胞色素C分布情況及caspase3、PARP蛋白的表達(dá)情況。 四.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理和分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。實(shí)驗(yàn)組和對照組刻板行為評分及基因表達(dá)量比較采用兩獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)；本文中其他基因、蛋白表達(dá)量的分析采用單因素方差分析(One-way ANOVA)比較各組差異,如方差齊性,多重比較采用LSD法,如方差不齊,采用Welch值,多重比較采用Dunnett T3法。P0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)果： 一. IGFBP5在METH處理的大鼠腦組織標(biāo)本和PC12細(xì)胞株中的表達(dá)情況 1.采用基因芯片檢測手段檢測IGFBPs在METH毒性損傷的PC12細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：IGF結(jié)合蛋白中的IGFBP4、IGFBP5及IGFBP7mRNA表達(dá)升高,IGFBP1、IGFBP2、 IGFBP3及IGFBP6mRNA表達(dá)不升高或不表達(dá)。 2.采用熒光定量PCR手段驗(yàn)證METH處理的PC12細(xì)胞中的IGFBP4、 IGFBP5、IGFBP7mRNA水平的特異性表達(dá)情況。結(jié)果顯示,METH處理的PC12細(xì)胞中只有IGFBP5mRNA表達(dá)顯著升高,IGFBP4以及IGFBP7mRNA表達(dá)未見升高。 3.建立急性METH中毒大鼠模型,選取大鼠紋狀體,采用熒光定量PCR手段驗(yàn)證IGFBP4、IGFBP5、IGFBP7mRNA在大鼠組織標(biāo)本中的特異性表達(dá)情況。結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組大鼠紋狀體組織中只有IGFBP5mRNA表達(dá)顯著升高,IGFBP4以及IGFBP7mRNA表達(dá)未見升高。 4.采用熒光定量PCR手段檢測不同濃度METH處理PC12細(xì)胞相同時(shí)間以及同一濃度METH處理PC12細(xì)胞不同時(shí)間的情況下IGFBP5mRNA表達(dá)情況。結(jié)果顯示,IGFBP5mRNA表達(dá)量與METH的處理濃度呈濃度依賴特性,與METH的處理時(shí)間呈時(shí)間依賴特性。同時(shí)采用Westen Blot方法IGFBP5蛋白表達(dá)情況,確定METH濃度和處理時(shí)間對IGFBP5的影響。結(jié)果顯示,IGFBP5蛋白表達(dá)量與與METH的處理濃度呈濃度依賴特性,與METH的處理時(shí)間呈時(shí)間依賴特性。并且,IGFBP5mRNA和蛋白表達(dá)量的上調(diào)在時(shí)間上符合。 二.IGFBP5基因沉默的PC12細(xì)胞在METH誘導(dǎo)下IGFBP5的表達(dá)及細(xì)胞的凋亡情況 1.針對IGFBP5基因設(shè)計(jì)并合成三條siRNA干擾序列,采用RNA干擾技術(shù)(RNAi)處理PC12細(xì)胞,采用熒光定量PCR方法檢測出有效干擾序列。結(jié)果證實(shí)其中兩條siRNA序列能夠沉默IGFBP5基因。 2.采用有效干擾序列沉默PC12細(xì)胞的IGFBP5基因表達(dá)后,用METH進(jìn)行處理,采用Westen Blot方法IGFBP5蛋白表達(dá)情況,確定IGFBP5的表達(dá)上升在METH的毒性損傷過程中是否為伴隨現(xiàn)象。結(jié)果顯示,IGFBP5基因沉默的PC12細(xì)胞與未沉默的細(xì)胞相比較,在METH的誘導(dǎo)下,其蛋白表達(dá)顯著下調(diào)。該結(jié)果證實(shí)IGFBP5在METH的毒性損傷過程中并不是伴隨現(xiàn)象,其參與調(diào)節(jié)METH的毒性損傷過程。 3.采用TUNEL法檢測IGFBP5基因沉默的PC12細(xì)胞經(jīng)METH處理后的細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示,IGFBP5基因沉默的PC12細(xì)胞與未沉默的細(xì)胞相比較,在METH的誘導(dǎo)下,其細(xì)胞凋亡率顯著下調(diào)。該結(jié)果再次證實(shí)IGFBP5在METH的毒性損傷過程中并不是伴隨現(xiàn)象,并且從反面說明IGFBP5在METH誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用中起促進(jìn)作用。 三.初步探測IGFBP5在調(diào)節(jié)METH誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用中的分子機(jī)制 1.采用Westen Blot方法檢測IGFBP5基因沉默的PC12細(xì)胞經(jīng)METH處理后細(xì)胞色素C分布情況及caspase3、PARP蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,IGFBP5基因沉默的PC12細(xì)胞與未沉默的細(xì)胞相比較,在METH的誘導(dǎo)下,細(xì)胞色素C由線粒體內(nèi)釋放至細(xì)胞質(zhì)內(nèi),caspase3蛋白表達(dá)顯著下調(diào),未活化型PARP及活化型PARP蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)。初步探明證實(shí)IGFBP5通過調(diào)節(jié)細(xì)胞色素C的釋放及caspase3、PARP的活性調(diào)節(jié)神經(jīng)元凋亡,其作用機(jī)制可能與線粒體凋亡途徑有關(guān)。 結(jié)論 1.IGFBP5在METH處理的大鼠紋狀體組織和PC12細(xì)胞株中均表達(dá)上調(diào),說明IGFBP5確實(shí)參與了METH誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元凋亡過程。 2.PC12細(xì)胞經(jīng)IGFBP5基因沉默處理后能降低METH誘導(dǎo)的細(xì)胞的凋亡,為IGFBP5參與METH誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程提供深層證據(jù),并且證明IGFBP5的上調(diào)并非為凋亡過程的伴隨現(xiàn)象,而是對METH誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元凋亡具有重要的調(diào)節(jié)作用。 3. IGFBP5基因沉默的PC12細(xì)胞與未沉默的細(xì)胞相比較,在METH的誘導(dǎo)下,細(xì)胞色素C由線粒體內(nèi)釋放至細(xì)胞質(zhì)內(nèi),caspase3蛋白表達(dá)顯著下調(diào),未活化型PARP及活化型PARP蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)。初步探明IGFBP5通過激活線粒體凋亡途徑,調(diào)節(jié)細(xì)胞色素C的釋放及caspase3、PARP的活性而調(diào)節(jié)神經(jīng)元凋亡。 本研究創(chuàng)新之處 1.第一次提出IGFBP5參與了METH的神經(jīng)損傷過程。 2.第一次提出IGFBP5調(diào)節(jié)了METH誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡。 3.第一次證明證實(shí)IGFBP5通過調(diào)節(jié)細(xì)胞色素C的釋放及caspase3、PARP的活性調(diào)節(jié)神經(jīng)元凋亡,其作用機(jī)制可能與線粒體凋亡途徑有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：甲基苯丙胺(METH) 胰島素樣生長因子5(IGFBP5) 神經(jīng)毒性 凋亡
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：D919
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 前言18-23
• 參考文獻(xiàn)19-23
• 技術(shù)路線23-24
• 第一章 IGFBP5在METH處理的大鼠腦組織標(biāo)本和PC12細(xì)胞株中表達(dá)情況24-50
• 一、材料與方法24-38
• 二、結(jié)果38-46
• 三、討論46-48
• 參考文獻(xiàn)48-50
• 第二章 IGFBP5基因沉默的PC12細(xì)胞在METH誘導(dǎo)下IGFBP5的表達(dá)及細(xì)胞凋亡情況50-70
• 一、材料與方法50-62
• 二、結(jié)果62-66
• 三、討論66-68
• 參考文獻(xiàn)68-70
• 第三章 初步探測IGFBP5在調(diào)節(jié)METH誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用中的分子機(jī)制70-85
• 一、材料與方法70-77
• 二、結(jié)果77-81
• 三、討論81-83
• 參考文獻(xiàn)83-85
• 全文小結(jié)85-87
• 中英文縮略詞表87-88
• 致謝88-89

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 G銉k，

本文編號(hào)：399725