本文關鍵詞：不同時程嗎啡依賴及急性嗎啡中毒對大鼠大腦皮層及海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:嗎啡具有很強的鎮(zhèn)痛作用,但同時又具有很高的成癮性。近年來嗎啡的濫用呈增高趨勢,嚴重危害了人類身心健康,社會安定和諧。臨床上,惡性腫瘤重度疼痛患者的嗎啡使用量往往超過常規(guī)劑量,用藥不規(guī)范可造成嚴重的后果。嗎啡依賴是指以失去控制能力、強迫性連續(xù)用藥為特征的慢性復發(fā)性腦疾病。急性嗎啡中毒是臨床上較常見的危急癥,中毒后主要表現(xiàn)為昏迷、呼吸深度抑制,嚴重缺氧時可導致休克、循環(huán)衰竭,甚至死亡[1]。我室前期研究表明不同時程嗎啡依賴可導致大腦局部神經(jīng)細胞的變性、壞死,但引發(fā)變性、壞死的機制有待進一步深入研究。有研究報道ERS(endoplasmic reticulum stress,ERS)可能參與了嗎啡導致的神經(jīng)損傷,ERS相關蛋白:糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)、磷酸化的真核細胞翻譯起始因子2α(Phosphorylated eukaryotic translation initiation factory 2α,p-p-eIF2α)、激活作用轉(zhuǎn)錄因子6(artificial transcription factor 6,ATF6)、CHOP是啟動ERS通路中的重要調(diào)節(jié)蛋白,它們在不同時程嗎啡依賴及急性嗎啡中毒中的表達狀態(tài),目前國內(nèi)外未見詳細報道。因此,本研究目的之一是探明不同時程嗎啡依賴及急性嗎啡中毒中以上ERS相關蛋白的表達變化,為嗎啡導致的神經(jīng)調(diào)節(jié)紊亂及損傷機制的研究提供病理形態(tài)學依據(jù)。迄今為止的研究表明,嗎啡能夠引起大腦出現(xiàn)急、慢性缺血缺氧,進而引起神經(jīng)纖維及神經(jīng)細胞發(fā)生多種病理學改變,引發(fā)明顯的神經(jīng)損傷。以往研究還表明腦損傷能夠刺激內(nèi)源性神經(jīng)干細胞(neural stem cells,NSCs)的增殖并能使新生的神經(jīng)細胞向損傷區(qū)分化遷移,這對神經(jīng)損傷的修復具有重要意義,但嗎啡依賴導致的神經(jīng)損傷后,內(nèi)源性NSCs的增殖及分化狀態(tài)目前國內(nèi)外未見詳細報道。因此,本研究的目的之二是采用增殖細胞核抗原Ki67及新生神經(jīng)細胞特異性標記物Nurr1,分別觀察不同時程嗎啡依賴導致大腦神經(jīng)損傷中內(nèi)源性NSCs的增殖及新生神經(jīng)細胞的表達狀態(tài),試圖為嗎啡導致神經(jīng)損傷的病理狀態(tài)提供科學依據(jù)。方法:1本實驗采用健康雄性Wistar大鼠,體重為(300±20)g,64只,分為嗎啡依賴1周對照組、嗎啡依賴1周組、嗎啡依賴3周對照組、嗎啡依賴3周組、嗎啡依賴6周對照組、嗎啡依賴6周組、急性嗎啡中毒對照組和急性嗎啡中毒組。嗎啡依賴3組大鼠按逐日遞增原則,背部皮下注射鹽酸嗎啡,每天二次(8:00,20:00),連續(xù)5天。劑量分別為10mg·kg-1,20mg·kg-1,30mg·kg-1,40mg·kg-1,50mg·kg-1。每次注射前均用75%酒精嚴格消毒,一次性注射器注射。5天后確認嗎啡依賴形成后,嗎啡依賴1周組、3周組、6周組分別給予30mg·kg-1鹽酸嗎啡背部皮下注射,一天兩次(8:00,20:00),分別連續(xù)注射至1周、3周、6周,建立三個不同時段的嗎啡依賴大鼠模型。對照組分別注射等劑量的生理鹽水。急性嗎啡中毒組采用未建立嗎啡依賴模型的健康大鼠一次性注射30mg·kg-1鹽酸嗎啡一次,急性對照組注射等劑量生理鹽水,兩小時后處死。模型建立后,腦組織經(jīng)固定、脫水、透明、包埋、連續(xù)切片等處理后待做各種染色使用。1)蘇木精-伊紅(HE)染色觀察常規(guī)病理學改變。2)硫堇特殊染色觀察神經(jīng)細胞尼氏體變化。3)免疫組織化學染色及免疫熒光染色觀察相關蛋白表達變化。2統(tǒng)計學分析:數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標準差(Mean±SD)”表示,用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析,各組均數(shù)的比較行單因素方差分析(ANOVA),用最小顯著差法(least significant difference,LSD)作兩兩比較,以P0.05為有顯著統(tǒng)計學差異。結(jié)果:1 HE染色結(jié)果對照組大腦皮層及海馬CA1區(qū)可見腦組織結(jié)構清晰,神經(jīng)細胞排列整齊;嗎啡依賴1周組未見明顯改變;嗎啡依賴3周組可見少量神經(jīng)細胞固縮,神經(jīng)細胞水腫,小膠質(zhì)細胞增生;嗎啡依賴6周組可見組織結(jié)疏松,神經(jīng)細胞水腫,部分神經(jīng)細胞固縮,小膠質(zhì)細胞增生明顯;急性嗎啡中毒組見部分細胞固縮。2硫堇染色結(jié)果對照組大腦皮層和海馬CA1區(qū)可見神經(jīng)細胞胞漿內(nèi)尼氏體清晰可見;嗎啡依賴1周組未見明顯改變;嗎啡依賴3周組尼氏體數(shù)目減少,結(jié)構不清;嗎啡依賴6周組尼氏體消失,細胞固縮;急性嗎啡中毒組出現(xiàn)細胞固縮。3免疫組織化學染色3.1 GRP78免疫組織化學染色結(jié)果與對照組相比,嗎啡依賴1周組與3周組大鼠大腦皮層GRP78陽性細胞數(shù)目逐漸增多;隨著嗎啡作用時間的進一步延長,在嗎啡依賴6周組陽性細胞數(shù)目減少;急性嗎啡中毒組陽性表達較正常組略有升高。嗎啡依賴各組及急性嗎啡中毒組中大鼠海馬CA1區(qū)GRP78陽性細胞表達均比對照組明顯增多,但嗎啡作用的各組間之間未見明顯差異。3.2 p-eIF2α免疫組織化學染色結(jié)果與對照組相比,嗎啡依賴1周組與3周組大鼠大腦皮層p-eIF2α陽性細胞數(shù)目逐漸增多;隨著嗎啡作用時間的進一步延長,嗎啡依賴6周組p-eIF2α陽性細胞數(shù)目減少;急性嗎啡中毒組陽性表達較正常組略有升高。嗎啡依賴各組大鼠海馬CA1區(qū)中神經(jīng)細胞p-eIF2α陽性細胞數(shù)目與對照組相比均未見明顯改變,急性嗎啡中毒組陽性表達較對照組略有升高。3.3 ATF6免疫組織化學染色結(jié)果與對照組相比,嗎啡依賴1周組與3周組大鼠大腦皮層及海馬CA1區(qū)ATF6陽性細胞數(shù)目逐漸增多;隨著嗎啡作用時間的進一步延長,在嗎啡依賴6周組ATF6陽性細胞數(shù)目減少;急性嗎啡中毒組陽性表達較對照組略有升高。3.4 CHOP免疫組織化學染色結(jié)果對照組大鼠神經(jīng)細胞胞漿及突起中CHOP呈現(xiàn)弱陽性表達狀態(tài),嗎啡依賴1周、3周組陽性數(shù)目逐漸增多;隨嗎啡作用時間的進一步延長,6周組較前兩組表達略有下降;急性嗎啡中毒組陽性表達較對照組略有升高。3.5 Ki67及MAP2免疫組織化學雙重染色結(jié)果嗎啡依賴1周組、3周組、6周組大鼠側(cè)腦室周圍神經(jīng)前體細胞Ki67陽性表達隨嗎啡依賴時間的延長與對照組相比呈下降趨勢;急性嗎啡中毒組陽性共表達較對照組未見明顯改變。3.6 Nurrl免疫組化化學染色結(jié)果隨嗎啡依賴時間的延長,嗎啡依賴各組中大鼠大腦皮層Nurrl陽性細胞數(shù)目與對照組相比逐漸減少;急性嗎啡中毒組陽性表達較對照組未見明顯改變。結(jié)論:本實驗通過建立不同時程嗎啡依賴大鼠與急性嗎啡中毒大鼠模型,通過HE染色、硫堇染色及免疫組織化學,免疫熒光染色觀察實驗結(jié)果,得出以下結(jié)論:不同時程的嗎啡依賴與急性嗎啡中毒均可以不同程度的導致大腦神經(jīng)細胞的損傷。ERS相關蛋白GRP78、p-eIF2α、ATF6、CHOP可能參與了神經(jīng)細胞的損傷,同時,在嗎啡依賴導致的神經(jīng)損傷中,Ki67及Nurr1的表達呈下降趨勢,提示嗎啡影響了內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的增殖及分化。
【關鍵詞】：嗎啡依賴 急性嗎啡中毒 GRP78 CHOP p-p-eIF2α ATF6 Ki67 Nurr1
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：D919
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-13
• 英文縮寫13-14
• 前言14-15
• 材料與方法15-24
• 結(jié)果24-28
• 附圖28-57
• 附表57-64
• 討論64-67
• 結(jié)論67-68
• 參考文獻68-71
• 綜述 神經(jīng)損傷后內(nèi)源性NSCs活化增殖、分化、遷移與修復71-82
• 參考文獻79-82
• 致謝82-83
• 個人簡歷83

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1 周麗華;黃矛;李s，

本文編號：343899