【摘要】： [背景] 死亡時(shí)間(Postmortem interval，PMI)推斷一直是法醫(yī)病理學(xué)實(shí)踐和研究的一項(xiàng)重、難點(diǎn)課題，尤其對(duì)晚期、腐敗的尸體，推斷其死亡時(shí)間更缺乏客觀、準(zhǔn)確的方法。以往研究主要關(guān)注于死后機(jī)體內(nèi)源性物質(zhì)隨時(shí)間延長(zhǎng)而降解的過程，因受到檢材保存和內(nèi)源性物質(zhì)降解時(shí)限的影響，研究時(shí)間范圍多局限于死后72h內(nèi)，如何拓展PMI推斷研究的時(shí)間范圍，尋找死后更長(zhǎng)時(shí)間的PMI推斷方法，是法醫(yī)學(xué)家面臨的新挑戰(zhàn)。 死亡后，尸體在微生物的作用下逐漸發(fā)生腐敗，腐敗產(chǎn)物也逐漸在組織中生成并積聚，腐敗微生物和腐敗產(chǎn)物的量隨著死亡時(shí)間的延長(zhǎng)，而呈現(xiàn)一定的變化規(guī)律。借鑒食品衛(wèi)生學(xué)中檢測(cè)食品中腐敗微生物和腐敗產(chǎn)物的含量判斷食品質(zhì)量、預(yù)測(cè)食品貨架期的思路，本實(shí)驗(yàn)對(duì)尸體腐敗過程中微生物和腐敗產(chǎn)物含量的檢測(cè)方法及其隨時(shí)間變化的規(guī)律進(jìn)行了一系列初步研究，探討利用腐敗過程推斷PMI的可行性。 [目的] 1．建立利用生物發(fā)光法檢測(cè)尸體組織中微生物ATP含量的方法。 2．檢測(cè)死后0～10d大鼠尸體組織中微生物ATP的含量，并分析其變化與PMI的關(guān)系，建立推斷PMI的回歸方程。 3．觀察尸體腐敗過程中腐敗細(xì)菌的生長(zhǎng)情況，并對(duì)優(yōu)勢(shì)腐敗菌種進(jìn)行鑒定。 4．建立檢測(cè)尸體組織中腐敗產(chǎn)物三甲胺-氮(TMA-N)的實(shí)驗(yàn)方法。 5．檢測(cè)死后0～10d大鼠尸體組織中TMA-N的含量，并分析其變化與PMI的關(guān)系，建立推斷PMI的回歸方程。 [方法] 1．處死健康SD大鼠，于死后不同時(shí)間取待檢組織樣本100mg，加入4℃無菌生理鹽水勻漿后，以3000r／min離心5min。取離心后上層清液50μl于檢測(cè)管內(nèi)，加入50μl的Triton X-100和三磷酸腺苷雙磷酸酶(Apyrase)混和液(其中Triton X-100濃度0．2％，Apyrase濃度0．1％)，37℃下孵育10min以消除組織細(xì)胞內(nèi)ATP，然后于沸水中水浴1min以滅活A(yù)pyrase。平衡至室溫后，加入100μl Bac Titer-Glo~(TM)檢測(cè)液，用TD-20／20 Luminometer檢測(cè)發(fā)光值(設(shè)置延時(shí)2s，檢測(cè)時(shí)間10s，連續(xù)測(cè)3次，取最高值為結(jié)果)。以無菌生理鹽水作空白對(duì)照，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算ATP濃度。進(jìn)行日內(nèi)檢測(cè)偏差和日間檢測(cè)偏差的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。 2．于死后即刻、1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d、9d、10d等11個(gè)時(shí)間點(diǎn)，按無菌操作要求，各取6只大鼠尸體的肌肉、肝臟、脾臟和腎臟組織，準(zhǔn)確稱取各組織樣本100mg，用生物發(fā)光法檢測(cè)各樣本中微生物ATP含量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 3．死后1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d、9d、10d等10個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取1只大鼠尸體的肌肉、肝臟、脾臟和腎臟組織少量，將樣品加無菌生理鹽水勻漿后，每份樣品以分區(qū)劃線法接種于2個(gè)血液增菌培養(yǎng)基上，分別置于37℃有氧和厭氧環(huán)境下培養(yǎng)24h。蘸取長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行涂片，革蘭氏染色后顯微鏡下觀察。分離純化優(yōu)勢(shì)菌種后，用VITEK-32型全自動(dòng)微生物分析儀進(jìn)行菌種鑒定。 4．大鼠尸體組織樣本100mg加入4℃10％三氯乙酸勻漿處理后，以3000r／min離心3min，取上層清液1 ml依次加入0．2ml 10％甲醛溶液、2ml無水甲苯、0．6ml 1：1碳酸鉀溶液，上下振搖60次，靜置后吸去下面水層，加入少許無水硫酸鈉脫水。取1ml上層液體加入已有1ml 0．02％苦味酸甲苯溶液的比色皿中，于410nm波長(zhǎng)下讀取光密度(OD)值，標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算TMA-N含量。進(jìn)行日內(nèi)、日間重復(fù)檢測(cè)及加樣回收率實(shí)驗(yàn)。 5．取健康SD大鼠處死，于死后即刻、1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d、9d、10d等11個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分別各取6只大鼠尸體的肌肉、肝臟、腎臟組織，用分光光度法檢測(cè)TMA-N濃度，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 [結(jié)果] 1．在10~(-6)mol／L～10~(-12)mol／L 6個(gè)數(shù)量級(jí)范圍內(nèi)，發(fā)光讀數(shù)(RLU)的對(duì)數(shù)值與ATP濃度([ATP])對(duì)數(shù)值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，以ATP濃度的對(duì)數(shù)值(Log([ATP]))為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)熒光讀數(shù)的對(duì)數(shù)值(Log(RLU))為縱坐標(biāo)，一元線性方程為y=0．815x+9．0148，R~2=0．9977，P＜0．001。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)顯示，平均日內(nèi)檢測(cè)偏差為1．40％；平均日間檢測(cè)偏差為1．74％。 2．大鼠死后肌肉組織中微生物ATP含量在7d內(nèi)隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，第8～9d下降，第10d再次升高；肝、脾和腎臟組織中微生物ATP含量在死后8d內(nèi)隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，8～10d下降。因肝、脾和腎臟組織中微生物ATP含量檢測(cè)結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性，故合并三個(gè)器官的數(shù)據(jù)為內(nèi)臟組。PMI在0～9d內(nèi)與肌肉組織中微生物ATP含量擬合最佳，以PMI為自變量的三次多項(xiàng)式回歸方程為：y=0．02x~3-0．166x~2-0．666x+13．412(R~2=0．989，P＜0．01)；在0～10d內(nèi)與內(nèi)臟組織中微生物ATP擬合最佳，以PMI為自變量的三次多項(xiàng)式回歸方程為：y=0．016x~3-0．127x~2-0．809x+13．324(R~2=0．986，P＜0．01)。 3．大鼠死后3天起，肌肉、肝臟、脾臟和腎臟組織中均有細(xì)菌生長(zhǎng)，菌種并不單一，可見G~-、G~+桿菌、G~+球菌等，但四種組織勻漿液培養(yǎng)的細(xì)菌中始終有一種G~-小型桿菌存在，在有氧和無氧條件下均可生長(zhǎng)。死后7～9d，四種組織中先后出現(xiàn)一種G~+的大桿菌，至死后10d，四種組織有氧和厭氧培養(yǎng)均可見。對(duì)優(yōu)勢(shì)菌種進(jìn)行菌種分析，鑒定結(jié)果為奇異變形桿菌。 4．在1 mg／L～10 mg／L范圍內(nèi)，光密度(OD)值與TMA-N濃度呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，一元線性方程為y=0．053x+0．001 8(y為OD值，x為TMA-N濃度)，R~2=0．9991，，P＜0．001。平均日內(nèi)檢測(cè)偏差為2．37％，平均日間檢測(cè)偏差為3．2％。平均加樣回收率為98．4％。 5．肌肉、肝臟和腎臟組織中TMA-N含量隨死亡時(shí)間延長(zhǎng)而增加，肌肉組織中TMA-N含量于死后第7d，肝臟和腎臟組織于死后第8d達(dá)到濃度高峰，隨后開始下降，于死后第10d再次升高；因肝、腎組織內(nèi)TMA-N含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性，故合并兩個(gè)器官的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析；PMI在2～7d內(nèi)與肌肉中TMA-N濃度變化擬合最優(yōu)，以PMI為自變量的三次多項(xiàng)式回歸方程為：y=-0．457x~3+6．51 9x~2—24．574x+27．207(R~2=0．969)；在3～8d內(nèi)與肝腎中TMA-N濃度變化擬合最優(yōu)，以PMI為自變量的三次多項(xiàng)式回歸方程為：y=0．509x~3-9．153x~2+55．727x-95．819(R~2=0．953)。 [結(jié)論] 1．本實(shí)驗(yàn)方法可靈敏、準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)尸體組織中的微生物ATP含量，填補(bǔ)了利用生物發(fā)光法檢測(cè)尸體組織內(nèi)微生物ATP含量方法的空白。 2．尸體組織中微生物ATP含量變化可用于PMI推斷，高度腐敗或不完整的尸體仍可以取材檢測(cè)，可大大拓寬PMI推斷研究的時(shí)間范疇。 3．尸體組織腐敗的優(yōu)勢(shì)菌種為奇異變形桿菌，死后7～10d組織中出現(xiàn)一種新的G~+大桿菌，其出現(xiàn)時(shí)間與微生物ATP、TMA-N含量變化趨勢(shì)發(fā)生波動(dòng)的時(shí)間范圍一致。 4．分光光度法檢測(cè)死后尸體組織中的TMA-N靈敏、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、重復(fù)性好，可用于進(jìn)一步檢測(cè)尸體組織內(nèi)TMA-N含量變化與PMI推斷的研究。 5．腐敗產(chǎn)物TMA-N含量可以用于推斷PMI，為晚期PMI推斷提供了新思路和新指標(biāo)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：D919

【引證文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2363899