本文選題：福爾馬林固定石蠟包埋組織　切入點：SNP　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2009年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 背景 福爾馬林固定石蠟包埋組織(Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissues,FFPET)是病理學(xué)、法醫(yī)病理學(xué)進(jìn)行疾病診斷和科學(xué)研究的常用檢材,并被長期保存,亦是涉嫌保險欺詐,醫(yī)療糾紛,財產(chǎn)繼承等刑事、民事案件的法醫(yī)物證檢材。目前,國內(nèi)醫(yī)院及科研機(jī)構(gòu)大多使用普通10%甲醛固定人體組織,普通福爾馬林溶液固定人體組織中DNA降解相對比較嚴(yán)重,提取高質(zhì)量的DNA并進(jìn)行PCR-STR分型較為困難。這使FFPET成為法醫(yī)物證疑難檢材之一。檢測FFPET也成為法醫(yī)物證學(xué)研究的重點和難點。 聯(lián)合DNA索引系統(tǒng)(CODIS)13個核心STR基因座的Plus和Cofiler等試劑盒,雖已廣泛應(yīng)用于血液、唾液、上皮組織、發(fā)根及骨組織的基因分型,但仍不能對FFPET進(jìn)行準(zhǔn)確分型。研究表明,福爾馬林固定時間、切片厚度以及不同的脫蠟方法均可影響FFPET提取DNA的質(zhì)量,從而影響其基因分型。而且不同組織的DNA降解程度有所不同。通過優(yōu)化蛋白酶消化條件,精簡DNA提取步驟和純化DNA模板雖能提高DNA純度和減少DNA額外損傷,但并不能給FFPET的基因分型帶來本質(zhì)的改觀;通過增加循環(huán)次數(shù)或采用巢式PCR等對PCR方法進(jìn)行調(diào)整與改良,可以提高擴(kuò)增產(chǎn)物量或擴(kuò)增特異性,但并未明顯改善其檢出率。因此,越來越多的學(xué)者將研究的重點轉(zhuǎn)移到如何有效地縮短擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度,以克服FFPET檢材中DNA嚴(yán)重降解對基因分型的影響,從而提高FFPET基因分型的成功率。大公司競相研發(fā)出擴(kuò)增片段較小的miniSTR商品化檢測試劑盒,提高了對降解DNA檢材的分型成功率,但仍然普遍存在諸如等位基因或位點丟失、不平衡峰、Pull-up峰等問題,影響了在實際檢案中的應(yīng)用。 單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)通常是指人類基因組中特定部位的單個堿基序列的變異。人類基因組中SNP含量豐富,每個個體存在數(shù)百萬個SNP。由于很多原因,SNP引起法醫(yī)工作者的關(guān)注。首先,SNP的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度可以小于100bp,而STR的擴(kuò)增產(chǎn)物都為300-400bp,因此SNP比STR更適用于降解的DNA樣本。第二,樣品的處理和數(shù)據(jù)分析易于自動化。第三,它的每個等位基因上不出現(xiàn)stutter帶,有助于簡化等位基因分析。在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,SNP最大的優(yōu)點就是可以得到短的PCR產(chǎn)物,從而為解決FFPET基因分型的難題提供了新的思路和途徑。 目的 本研究探討不同時間福爾馬林固定石蠟包埋組織DNA降解情況,保證擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度小于100bp為基本條件,針對具有較高雜合度的SNP基因座自行設(shè)計等位基因特異性引物,通過SNP基因座與STR(D2S441)基因座對FFPET檢材基因分型結(jié)果的比較,探討采用短擴(kuò)增子ASPCR技術(shù)對FFPET進(jìn)行SNP分型的可行性與優(yōu)越性。并調(diào)查了rs1454361、rs2046361基因座在中國重慶漢族群體的頻率分布。 實驗分為兩部分 一、福爾馬林固定不同時間石蠟包埋組織DNA降解程度與SNP分型成功率的研究 材料與方法: 1、FFPET取自重慶醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)教研室,3個例尸體解剖提取的肝臟、肺臟、皮膚、骨骼肌、腦,用福爾馬林溶液固定5d,10d,15d,按常規(guī)方法制作FFPET樣品,切取10μm厚切片,每4片放入一個1.5ml的無菌離心管中。同時取上述尸體心臟血各2ml作為陽性對照。(同時常規(guī)切片HE染色,顯微鏡下觀察確保組織結(jié)構(gòu)清晰,無自溶、壞死、和大片出血) 2、采用瓊脂糖凝膠電泳對FFPET樣本的DNA進(jìn)行質(zhì)量檢測。 3、分別應(yīng)用SNP-ASPCR技術(shù)與PCR-STR技術(shù)對FFPET檢材進(jìn)行基因分型,并對兩者的分型成功率與分型效果進(jìn)行比較。 結(jié)果 1、瓊脂糖凝膠電泳顯示,血液樣品提取DNA的電泳譜帶纖細(xì)清亮,電泳遷移率低;FFPET樣品提取DNA的電泳譜帶成彌散狀,電泳遷移率高。通過與DNA Marker比較,片段長度主要分布于200bp以下,5d組各FFPET樣品片段長度主要分布于100bp-200bp,10d組腦組織片段長度主要分布于50bp以下,其余分布100bp左右,15d組只有肝臟樣品片段長度分布于100bp,其余分布于50bp以下。 2、采用ASPCR技術(shù)對rs1454361與rs2046361基因座進(jìn)行分型,5d組rs1454361的檢出率為14/15(有1例腦組織來源的FFPET樣品未檢出PCR產(chǎn)物),rs2046361的檢出率為13/15(有2例腦組織來源的FFPET樣品未檢出PCR產(chǎn)物)。10d天組腦組織來源的FFPET樣品全部未檢出PCR產(chǎn)物,其余各臟器來源的FFPET樣品的檢出率也下降,rs1454361的檢出率為7/15,rs2046361的檢出率為6/15。15d組僅僅肝臟來源的FFPET樣品有檢出PCR產(chǎn)物。rs1454361的檢出率為2/15,rs2046361的檢出率為1/15。通過與陽性對照結(jié)果比對,均分型正確,其譜帶亦清晰可辨。采用PCR-STR分型技術(shù)對D2S441檢測結(jié)果顯示:部分樣品泳道濃染,譜型發(fā)生明顯改變,導(dǎo)致無法判型,部分樣品未檢出相應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物。 二、中國重慶地區(qū)漢族群體rs1454361與rs2046361基因座遺傳多態(tài)性研究 材料與方法 119例中國重慶地區(qū)無血緣關(guān)系個體血液樣品,由重慶醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)教研室分子生物學(xué)實驗室提供。采用短擴(kuò)增子ASPCR技術(shù)建立rs1454361、rs2046361基因座分型系統(tǒng),檢測該基因座在中國重慶地區(qū)漢族群體樣本中的多態(tài)分布,直接計數(shù)法計算其基因型頻率與等位基因頻率,并進(jìn)行Hardy—Weinberg平衡檢驗。采用PowerStatesV12軟件計算其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用指標(biāo)。 結(jié)果 119例中國重慶地區(qū)無血緣關(guān)系個體中:rs1454361:TT型32例(26.89%),TA型56例(47.05%),AA型31例(26.05%),T等位基因與A等位基因頻率分別是0.5042和0.4958;rs 2046361 :TT型29例(24.37%),TA型69例(57.98%) ,AA型21例(17.65%),T等位基因與A等位基因頻率分別是0.5336和0.4664。采用χ2檢驗進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗的結(jié)果為rs1454361:χ2=0.4108,p0.05;rs2046361:χ2=3.2370,p0.05。應(yīng)用PowerStatsV12對rs1454361與rs2046361基因座群體調(diào)查結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,獲得如下法醫(yī)學(xué)應(yīng)用參數(shù): rs1454361/ rs2046361基因座H、DP、Pm、PE、PIC分別為0.471/0.58、0.638/0.573、0.362/0.427、0.163/0.267、0.37/0.37。 結(jié)論 1、福爾馬林固定后的FFPET樣品提取的DNA高度降解,肝臟降解最輕,腦組織降解最嚴(yán)重。片段長度主要分布在200bp以下,集中于100bp左右。 2、SNP-ASPCR技術(shù)在對FFPET之類高度降解DNA檢材的基因分型方面,具有較高的檢出成功率,其效果明顯優(yōu)于PCR-STR技術(shù)。 3、rs1454361與rs2046361基因座在中國重慶漢族群體中具有良好的多態(tài)性分布,在法醫(yī)學(xué)上具有較高的應(yīng)用價值。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：D919;R346

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本文編號：1575013