本文關鍵詞：束縛應激加重擠壓傷大鼠腸道損傷及內質網應激蛋白的表達變化　出處：《河北醫(yī)科大學》2016年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：目的:在法醫(yī)實際工作中,當事人在經受非致命性損傷的一段時間后出現多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)甚至死亡的案例時有發(fā)生,如持續(xù)捆綁或限制體位等束縛情形下發(fā)生MODS,由于損傷本身較輕微不足于造成死亡,常常由于死亡原因爭議較大,導致案件久拖不決。因此,研究非致命性損傷對機體各器官形態(tài)和機能的影響,對于揭示發(fā)生死亡的確切機制具有重要意義。認真分析上述案件的背景不難發(fā)現存在一個共同的特點,即均存在明確的心理應激狀況。機體發(fā)生應激反應時,藍斑-交感-腎上腺髓質系統(tǒng)(Locus ceruleus-norepinephrine system,LC/NE)及下丘腦-垂體-腎上腺皮質系統(tǒng)(Hypothalamus-pituitary-adrenal cortex system,HPA)的興奮性增強,血中兒茶酚胺(catecholamine,CA)濃度水平快速升高,一系列功能代謝改變隨之發(fā)生,起到防御代償的作用。但過強或持續(xù)時間過長的應激卻可導致多種器官功能障礙和代謝紊亂,其能力儲備及防御機制被逐漸消耗,內環(huán)境嚴重失調、紊亂,直至出現一個或多個器官衰竭和死亡。目前能夠復制精神心理應激的動物模型中較為成熟的是束縛應激模型,本室以往研究表明,束縛應激對擠壓傷大鼠心、肝、腎的損傷有加重作用,能夠引起MODS,提示非致命性損傷致死的過程里,心理應激造成的臟器損傷可能起一定作用。當今社會,科技發(fā)展日新月異,社會競爭日趨激烈,應激導致的人群健康問題越發(fā)嚴重。應激引起的腸道疾病越來越受到人們關注。腸道屏障由腸上皮細胞及其細胞間的緊密連接組成,是具有多種功能的復合體。應激狀態(tài)下腸道發(fā)生損傷或功能障礙,則會發(fā)生細菌移位和內毒素血癥,甚至引起全身炎癥反應綜合征。研究表明,束縛應激可以損傷腸道屏障,可能引發(fā)慢性結腸炎癥,其機制可能有多種因素比如免疫失調、微生物環(huán)境的改變等,提示腸道對心理應激極其敏感,但具體機制尚不清楚。內質網的主要功能為合成、加工蛋白質以及貯存Ca~(2+)。應激激素、細胞因子及氧自由基對內質網功能都有干擾作用,形成大量的未/錯誤折疊蛋白,葡萄糖調節(jié)蛋白78(glucose regulating protein 78,GRP78)、磷酸化真核細胞翻譯起始因子2α(Phosphorylated Eukaryotic translation initiation factory 2α,P-e IF2α)及CHOP等內質網應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)蛋白表達增加,ERS過程被激活。在細胞的防御適應反應過程里,ERS雖是其中的重要部分,但ERS強度過高或持續(xù)時間過長時則可誘導細胞凋亡和炎癥反應造成細胞和組織損傷。目前的研究表明,ERS參與了炎癥性腸病的發(fā)生發(fā)展,那么在應激造成腸道損傷過程中,ERS標志蛋白GRP78、P-e IF2α及CHOP的表達狀態(tài)如何,目前國內外未見文獻報道。綜上,本實驗為了模擬實際案件中非致命性損傷和心理應激共同參與的情況,建立了擠壓傷和束縛應激的復合模型,探討損傷和應激共同作用下大鼠腸組織的病理學改變及內質網應激蛋白GRP78、P-e IF2α及CHOP的表達變化,嘗試初步探討非致命損傷與心理應激同時作用導致死亡的機制。方法:1健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠,體重220~240g,于控制條件下適應性喂養(yǎng)一周后,隨機分為四組(每組6只)。(1)對照組(Con):大鼠于固定時間禁食水(每日8h或10h交替進行)。(2)束縛應激組(Rs):大鼠于固定時間放入束縛應激模具內進行束縛,同時禁食水(每日8h或10h交替進行)。(3)擠壓傷組(CI):大鼠用無水乙醚麻醉后,于雙后肢上壓24kg重物,連續(xù)擠壓6小時,此后不再進行擠壓,每日相應時間禁食水。(4)復合模型組(Com):大鼠連續(xù)擠壓6小時,于當日晚開始進行束縛(每日8h或10h交替進行)。通過記錄體重、行為學改變,以評估是否成功建立束縛應激模型。通過觀察大鼠擠壓后局部表現、活動狀態(tài)等證明擠壓傷模型是否建立成功。造模7天后用10%水合氯醛腹腔注射麻醉,腹主動脈取血、離心、取上清,用于檢測兒茶酚胺濃度。于冰上迅速取出腸道組織(回腸)放入4%的多聚甲醛溶液中固定。制作石蠟切片,進行HE染色觀察組織病理學改變,同時應用免疫組織化學染色(IHC)方法觀察ERS相關蛋白GRP78、CHOP、P-e IF2α蛋白表達的變化。2數據以“均數±標準差(Mean±SD)”表示,用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析,各組均數的比較行單因素方差分析(ANOVA),用最小顯著差法(least significant difference,LSD)或Tamhane’s(t2)作兩兩比較,以P0.05為有顯著統(tǒng)計學差異。結果:1大鼠體重測量結果對照組大鼠體重逐漸增重,與對照組相比較束縛應激組大鼠體重增長速度緩慢較明顯,P0.01。表明束縛應激大鼠模型的建立已成功。2大鼠血漿中NE、E的濃度動態(tài)變化的檢測擠壓傷組大鼠血漿中NE、E濃度與對照組相比無統(tǒng)計學意義。與擠壓傷組相比,束縛應激組和復合模型組大鼠血漿中NE、E濃度均呈現明顯升高,P0.01。3 HE染色結果常規(guī)組織病理學觀察結果顯示,正常對照組回腸組織結構清晰,黏膜排列整齊,未見炎癥水腫及其他病理學改變;束縛應激組回腸黏膜上皮細胞輕度水腫,局部可見散在小灶性炎細胞浸潤;擠壓傷組黏膜上皮細胞輕度水腫,黏膜組織內炎細胞浸潤較明顯,局部可見黏膜上皮細胞增生;復合模型組組織病理學變化最明顯,可見黏膜內及黏膜間質多量炎細胞浸潤,部分區(qū)域黏膜上皮細胞增生明顯,局部淋巴濾泡增生明顯。4 GRP78、P-e IF2α及CHOP蛋白免疫組織化學檢測結果免疫組化染色結果顯示,三種蛋白的表達變化趨勢一致。正常對照組回腸黏膜上皮細胞的胞漿內可見弱陽性表達;束縛應激組和擠壓傷組與正常對照組相比,黏膜上皮細胞胞漿內陽性表達均呈增高趨勢;與擠壓傷組相比,復合模型組陽性表達明顯增高。結論:本實驗成功建立了大鼠擠壓傷和束縛應激的復合模型,通過觀察腸道組織病理學改變、檢測血漿中CA濃度以及腸組織GRP78、P-e IF2α、CHOP蛋白的表達變化,證實了束縛應激可加重擠壓傷大鼠腸道組織損傷,ERS參與這一損傷過程。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：D919

【參考文獻】

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