本文關(guān)鍵詞：運(yùn)用RNA降解規(guī)律構(gòu)建數(shù)學(xué)模型推斷死亡時(shí)間

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【摘要】：死亡時(shí)間(postmortem interval,PMI)是指發(fā)現(xiàn)、檢查尸體時(shí)距死亡發(fā)生時(shí)的時(shí)間間隔。PMI的準(zhǔn)確推斷具有重要的法醫(yī)學(xué)實(shí)踐價(jià)值,一直是法醫(yī)學(xué)病理學(xué)研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。利用傳統(tǒng)的方法進(jìn)行死亡時(shí)間的推斷一直受到各種因素的制約,如環(huán)境溫度,死亡原因等,導(dǎo)致推斷的準(zhǔn)確性和精確性較低。隨著分子生物學(xué)技術(shù)在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用,利用生物體內(nèi)RNA的時(shí)間依賴性降解規(guī)律推斷死亡時(shí)間正逐漸成為目前研究的熱點(diǎn)。實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative real time PCR, qRT-PCR)作為RNA表達(dá)量的精確定量技術(shù),具有準(zhǔn)確高效的優(yōu)點(diǎn),被越來(lái)越多的應(yīng)用于PMI的推斷,但其結(jié)果必須依賴于穩(wěn)定內(nèi)參指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)化,目前構(gòu)建的推斷PMI模型相對(duì)單一,通常只考慮單個(gè)因素的影響,而忽略多組織、多溫度和多死因的探討,實(shí)際應(yīng)用受限。本實(shí)驗(yàn)利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù),檢測(cè)已知明確死亡時(shí)間的人體組織和動(dòng)物模型組織中(心肌、肝臟和皮膚)多個(gè)RNA指標(biāo)的表達(dá)量,以期發(fā)現(xiàn)受各因素影響較小的RNA指標(biāo)作為標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)參指標(biāo)。在此基礎(chǔ)上,針對(duì)大鼠組織內(nèi)特定RNA指標(biāo)進(jìn)行死后不同時(shí)間的規(guī)律性研究,綜合多個(gè)分子指標(biāo)構(gòu)建多組織、多溫度組的數(shù)學(xué)模型用以推斷死亡時(shí)間；將明確死亡時(shí)間的大鼠樣本和人體資料代入方程進(jìn)行驗(yàn)證,探討環(huán)境溫度及死亡原因等因素對(duì)死亡時(shí)間推斷的影響程度,以期為人體死亡時(shí)間的精確推斷提供新的方法與理論基礎(chǔ)。此外,本研究也通過(guò)構(gòu)建不同死因的大鼠模型,檢測(cè)心肌多種RNA指標(biāo)在死后不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)變化情況,以期為不同死因下的死亡時(shí)間推斷提供一種新的思路。研究目的1.通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)人體組織及大鼠組織中各RNA指標(biāo)的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測(cè),旨在尋找出穩(wěn)定通用的內(nèi)參標(biāo)志物用以精確的推斷死亡時(shí)間。2.設(shè)置四個(gè)連續(xù)的溫度組,明確斷頸死大鼠三種組織中各RNA死后降解規(guī)律與死亡時(shí)間的相互關(guān)系,利用標(biāo)準(zhǔn)化的qRT-PCR數(shù)據(jù)構(gòu)建多參數(shù)數(shù)學(xué)模型推測(cè)死亡時(shí)間。利用已知死亡時(shí)間的大鼠樣本和人體樣本進(jìn)行數(shù)學(xué)模型的驗(yàn)證,統(tǒng)計(jì)推斷死亡時(shí)間和真實(shí)死亡時(shí)間之間的誤差率,明確環(huán)境溫度及死亡原因等因素對(duì)死亡時(shí)間推斷的影響。3.構(gòu)建斷頸死、窒息死和失血性休克三種大鼠死亡模型,明確不同死亡原因下大鼠心肌內(nèi)多種RNA表達(dá)量隨隨死亡時(shí)間的降解規(guī)律,以期為不同死因下死亡時(shí)間的推斷提供參考。方法和結(jié)果第一部分1.委托上海市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所收集79例人體案例樣本組織,每例尸體都準(zhǔn)確的記錄死亡時(shí)間、溫度、死因等。每例尸體均取心肌、肝臟和皮膚組織分裝于RNAlater保護(hù)液,置于-80℃凍存、備用。2.斷頸處死288只SD大鼠用以構(gòu)建模型,尸體立即放置于恒定環(huán)境溫度下(5±1℃、15±1℃、25±1℃和35±1℃),于死后12個(gè)時(shí)間點(diǎn)(Oh、1h、3h、6h、12h、 24h、36h、48、72h、96h、120h和144h)分別取出心肌組織、肝臟和皮膚組織；斷頸處死6只SD大鼠用以驗(yàn)證模型,放置于恒定環(huán)境溫度下(10±1℃和20±1℃),于后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)(15h、45h and 95h)取出三種組織；所有組織分裝于RNAlater保護(hù)液,置于-80℃凍存、備用。選取12個(gè)常用的RNA分子指標(biāo),并設(shè)計(jì)引物,分別是ACTB、GAPDH、18S、RPS29、5S、U6、let-7a、miR-1、miR-133a、miR-206、miR-122和miR-203。3.用TRIzol法抽提人體和大鼠組織的總RNA、總RNA濃度和純度檢測(cè)和cDNA合成,并應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)RNA指標(biāo)的循環(huán)閾值(cycle threshold,Ct)。4.通過(guò)geNorm軟件對(duì)12個(gè)候選分子標(biāo)志物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,選取人體組織與動(dòng)物組織相統(tǒng)一的內(nèi)參指標(biāo)。結(jié)果顯示：5S、U6、miR-133a和RPS29適合作為心肌組織的內(nèi)參,5S、U6、RPS29和miR-122適合作為肝臟組織的內(nèi)參,5S、U6、RPS29和miR-203適合作為皮膚組織的內(nèi)參。第二部分5.對(duì)ACTB和GAPDH的Ct值進(jìn)行內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化處理,建立循環(huán)閾值差值(deltaCt,△Ct)與PMI的回歸方程(一次、二次和三次方程),擇優(yōu)選擇構(gòu)建數(shù)學(xué)模型。6.將已知PMI的大鼠樣本和人體樣本△Ct值帶入方程進(jìn)行驗(yàn)證,統(tǒng)計(jì)推測(cè)PMI的誤差率,明確環(huán)境溫度、死亡原因等因素對(duì)精確PMI推斷的影響。驗(yàn)證結(jié)果表明大鼠樣本的總誤差率為14.4±2.2%,人體樣本的總誤差率為34±19%,證實(shí)運(yùn)用該數(shù)學(xué)模型推斷PMI相對(duì)準(zhǔn)確有效。7.研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境溫度升高可以明顯的增加RNA的降解速率,詳細(xì)的環(huán)境溫度記錄可以有效的提高推斷PMI的精度。8.在三種組織中,肝臟組織擁有最低的誤差率,尤其適合早期PMI的推斷；而心肌組織更適合用于晚期PMI的推斷；雖然皮膚組織具有最高的誤差率,但在某些特殊案件如碎尸案有無(wú)可取代的價(jià)值。9.死亡原因也對(duì)RNA表達(dá)量具有影響,GAPDH表達(dá)量在失血性休克樣本和機(jī)械性窒息樣本中表達(dá)上調(diào),導(dǎo)致推斷的PMI小于真實(shí)PMI,誤差率為負(fù)值。第三部分10.135只SD大鼠隨機(jī)分為斷頸死組、窒息死組和失血性休克死組,尸體保存于室溫(25±1℃)環(huán)境下,于死后9個(gè)時(shí)間點(diǎn)(Oh、3h、6h、12h、24h、36h、48h,72h和96h)提取心肌組織,分裝于RNA later保護(hù)液中,置于-80℃凍存、備用。并應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)GAPDH、ACTB、HIF-1、iNOS、TNF-α、IL-6和U6的Ct值,觀察各RNA在不同死因下隨PMI的變化情況。11.U6非常穩(wěn)定,受PMI和死因的影響較小,適合作為內(nèi)參指標(biāo)。在死亡早期,GAPDH、HIF-1、iNOS、TNF-α和IL-6的表達(dá)量在窒息死組和失血性休克死組比斷頸死組呈現(xiàn)不同程度的增加,而ACTB在三個(gè)組皆呈現(xiàn)表達(dá)量下降趨勢(shì)。在死亡晚期,隨著mRNA的不斷降解,各RNA指標(biāo)表達(dá)量持續(xù)下降。因此,死后各RNA相對(duì)表達(dá)量隨PMI的特征性的變化可為不同死因下PMI的推斷提供參考。結(jié)論與展望本課題按照標(biāo)準(zhǔn)化的qRT-PCR技術(shù)流程,篩選出穩(wěn)定通用的內(nèi)參標(biāo)志物,并通過(guò)多溫度、多組織的動(dòng)物模型,綜合多個(gè)分子指標(biāo)構(gòu)建數(shù)學(xué)模型推斷死亡時(shí)間。應(yīng)用大鼠樣本和實(shí)際案例檢驗(yàn)數(shù)學(xué)模型,較低的誤差率證實(shí)此方法的精確性和可靠性,同時(shí)探討環(huán)境溫度及死亡原因等因素對(duì)于死亡時(shí)間判斷的影響程度。本課題將繼續(xù)收集人體樣本(增加樣本種類、數(shù)量)進(jìn)行大量的組織驗(yàn)證,進(jìn)一步優(yōu)化數(shù)學(xué)模型,提高人體死亡時(shí)間推斷的精確性,使之更有利于法醫(yī)實(shí)際工作的開(kāi)展。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：D919

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 潘暉;呂葉輝;張恒;陳龍;;mRNA和microRNA在機(jī)械性窒息死推斷中的研究進(jìn)展[J];中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志;2014年02期

2 馬劍龍;陳龍;;死亡時(shí)間推斷的方法學(xué)研究進(jìn)展[J];中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志;2015年05期

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 張凌宇;大鼠骨骼肌挫傷后ASCT2 mRNA時(shí)序性表達(dá)研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2013年

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本文編號(hào)：1260259