本文關(guān)鍵詞：四物湯有效成分代表性組分藥代動力學(xué)相互作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》 2014年

四物湯有效成分代表性組分藥代動力學(xué)相互作用研究

黃開福  

【摘要】：中藥復(fù)方四物湯是中醫(yī)補(bǔ)血活血的經(jīng)典良方，由于其具有補(bǔ)血養(yǎng)肝和活血調(diào)經(jīng)的顯著功效，，臨床上常用于血虛、血滯之證和婦科疾病的治療。四物湯由熟地黃、當(dāng)歸、白芍和川芎四味藥材組成，分別為四物湯的“君臣佐使”藥。研究表明四物湯中果糖（熟地黃）、阿魏酸（當(dāng)歸和川芎）、芍藥苷（白芍）和川芎嗪（川芎）4個成分在受60Co輻射致貧血的小鼠體內(nèi)具有生血的作用；同時(shí)，當(dāng)4個成分同時(shí)配伍給藥后，芍藥苷和阿魏酸兩個單體引起的體重減輕作用消失，而這種作用可能是一種不良的反應(yīng)。 本課題的研究目的是通過四物湯有效成分代表性組分在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)相互研究，探討其與中醫(yī)“君臣佐使”理論的相關(guān)性，為四物湯有效成分組方制劑的研究與開發(fā)提供具有重要指導(dǎo)意義的數(shù)據(jù)信息。根據(jù)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)挖掘和前期的研究，從熟地黃、當(dāng)歸、白芍和川芎中分別選出1～3個有效成分，通過測定有效成分在藥材中的含量以及考察四物湯和四物合劑在體內(nèi)活性成分吸收入血的情況，從而確定了熟地黃、當(dāng)歸、白芍和川芎的有效成分中各自具有代表性的組分。最終，通過代表性組分的組合配伍，研究代表性組分在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)相互作用。 第一部分HPLC法測定四物湯配伍藥材提取液中9個有效成分的含量 經(jīng)前期的研究和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)的挖掘，從四味藥材中分別選擇以下9個有效成分作為研究對象，即：5-羥甲基糠醛、梓醇和毛蕊花糖苷(熟地黃)；丁苯酞、藁本內(nèi)酯和阿魏酸（當(dāng)歸）；芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷（白芍）；丁苯酞、藁本內(nèi)酯和阿魏酸川芎嗪（川芎）。建立9個有效成分的高效液相色譜分離方法，分別對四味藥材的提取液中對應(yīng)各有效成分的含量進(jìn)行分析。 熟地黃和川芎嗪采用50%甲醇水進(jìn)行超聲提取，當(dāng)歸和白芍分別采用70%甲醇水和50%乙醇水進(jìn)行超聲提取。以乙腈：水（0.5%H3PO4）為流動相，色譜柱Agilent HC-C18（4.6×250mm；5μm）進(jìn)行分離，對提取液進(jìn)行HPLC分析。 結(jié)果表明，5-羥甲基糠醛和毛蕊花糖苷在熟地黃中的含量約為0.14%和0.07%；丁苯酞、藁本內(nèi)酯和阿魏酸在當(dāng)歸中的含量約分別為0.01%、2.05%和0.04%，芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷在白芍中的含量約分別為2.27%和0.41%；5-羥甲基糠醛、川芎嗪和阿魏酸在川芎中的含量約分別為0.02%、0.02%和0.06%。 綜上所述，9個有效成分在藥材中的含量差異較大，其中藁本內(nèi)酯、芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的含量較高，可作為重點(diǎn)關(guān)注的有效成分。 第二部分四物湯和四物合劑在大鼠體內(nèi)的入血有效成分及其藥動學(xué)性質(zhì) 建立該9個有效成分的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）的分離檢測方法，研究口服給藥后，四物湯和四物合劑在大鼠體內(nèi)吸收入血的有效成分及其藥代動力學(xué)性質(zhì)。 分別將四物湯和四物合劑臨床用水煎液進(jìn)行凍干，并用LC-MS/MS測定了各有效成分的含量。Wistar大鼠隨機(jī)成四物湯組和四物合劑組，于給藥前、給藥后不同時(shí)間點(diǎn)采集血樣。大鼠血漿樣品用乙腈進(jìn)行蛋白沉淀處理，用LC-MS/MS檢測血漿樣品中的各有效成分含量。血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)由WinNonlin5.2統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行藥代參數(shù)的計(jì)算，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析由SAS9.2軟件進(jìn)行處理。 經(jīng)LC-MS/MS方法測定，在兩個方劑凍干后的水復(fù)溶液中都檢測到了梓醇、藁本內(nèi)酯、丁苯酞、芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷，其在四物湯和四物合劑中的濃度分別為2.94、244.67、4.24、1411.65、261.83mg L-1和3.64、255.50、4.68、1456.65、297.00mg L-1。毛蕊花糖苷、阿魏酸和川芎嗪兩個方劑中的含量都低于其檢測限。 灌胃給藥四物湯和四物合劑后，在大鼠血漿中可以檢測到少量梓醇，但無法準(zhǔn)確定量；含量偏高且能夠準(zhǔn)確定量的成分是芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷。四物湯組與四物合劑組中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷在大鼠體內(nèi)吸收和消除均較快。二者的主要藥動學(xué)參數(shù)（T1/2，Tmax，Cmax和AUC等）在四物湯組和四物合劑組之間的無顯著差異。 綜上所述，梓醇、芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷均可作為四物湯有效成分代表性組分；藥材配伍比例的變化對芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的藥動學(xué)性質(zhì)無顯著影響。 第三部分測定生物樣品中梓醇、藁本內(nèi)酯、阿魏酸、芍藥苷和川芎嗪含量的LC-MS/MS方法建立和確證 依上述結(jié)果，梓醇、藁本內(nèi)酯、阿魏酸、芍藥苷和川芎嗪可作為四物湯有效成分的代表性組分。本部分的目的是建立測定大鼠血漿中梓醇、藁本內(nèi)酯、阿魏酸、芍藥苷和川芎嗪的LC-MS/MS方法，為研究臨床血虛患者口服中藥復(fù)方四物湯和四物合劑后梓醇、藁本內(nèi)酯、阿魏酸、芍藥苷和川芎嗪在人血清的含量，以及研究梓醇、藁本內(nèi)酯、阿魏酸、芍藥苷和川芎嗪等5個有效成分組合配伍給藥前后在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)相互作用提供檢測分析手段。 梓醇以甲醇和水（含5mM甲酸銨）作為流動相，色譜柱為Diamonsil C18(2.1×150mm；5μm)進(jìn)行分離，采用MRM（多反應(yīng)監(jiān)測）和正離子模式的檢測方式，內(nèi)標(biāo)為桃葉珊瑚苷。藁本內(nèi)酯和川芎嗪以甲醇:0.1%甲酸（78:28）作為流動相恒梯度洗脫，色譜柱為Thermo Syncronis C18(2.1×150mm；3.7μm)進(jìn)行分離，采用MRM（多反應(yīng)監(jiān)測）和正離子模式的檢測方式，內(nèi)標(biāo)為地西泮。芍藥苷和阿魏酸以乙腈和水（0.1%甲酸）作為流動相，色譜柱為Thermo Syncronis C18(2.1×150mm；3.7μm)進(jìn)行分離，采用MRM（多反應(yīng)監(jiān)測）和負(fù)離子模式的檢測方式，內(nèi)標(biāo)為葛根素。 血漿樣品前處理采用乙腈沉淀蛋白，對測定大鼠血漿中梓醇、藁本內(nèi)酯、阿魏酸、芍藥苷和川芎嗪的LC-MS/MS方法進(jìn)行全確證，內(nèi)容包括方法的專屬性、方法的精密度和準(zhǔn)確度、稀釋效應(yīng)、基質(zhì)效應(yīng)、回收率和穩(wěn)定性。 結(jié)果表明，大鼠血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾梓醇等有效成分的測定；批內(nèi)和批間精密度和準(zhǔn)確度均在±15%以內(nèi)，精密度和準(zhǔn)確度良好，符合生物樣品分析的要求；梓醇和藁本內(nèi)酯的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品稀釋5倍（5000→1000；500→100）后，精密度和準(zhǔn)確度均在±15%以內(nèi)，表明無明顯稀釋效應(yīng)；梓醇、藁本內(nèi)酯、阿魏酸、芍藥苷和川芎嗪的基質(zhì)效應(yīng)均在85.73%～107.19%的范圍內(nèi)，回收率則在90.93%～108.63%的范圍內(nèi)，表明方法無明顯的基質(zhì)效應(yīng)，回收率符合生物樣品分析的要求；大鼠血漿中的梓醇、藁本內(nèi)酯、阿魏酸、芍藥苷和川芎嗪分別進(jìn)行室溫放置4h、樣品處理后4℃進(jìn)樣器放置24h、反復(fù)凍（-20℃）融（室溫）3次和長期凍存后，所測得的RSD%和RE%值均在±15%以內(nèi)，表明梓醇、藁本內(nèi)酯、阿魏酸、芍藥苷和川芎嗪在上述條件下穩(wěn)定性良好。 綜上所述，實(shí)驗(yàn)建立了可同時(shí)檢測大鼠血漿中藁本內(nèi)酯和川芎嗪、可同時(shí)檢測大鼠血漿中芍藥苷和阿魏酸以及大鼠血漿中梓醇的3個LC-MS/MS方法，該3個方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高和重復(fù)性好，適用于梓醇、藁本內(nèi)酯、阿魏酸、芍藥苷和川芎嗪的體內(nèi)研究。 第四部分臨床受試者口服四物湯和四物合劑后血清中代表性有效成分的分析 利用所建立的測定生物樣品中梓醇、藁本內(nèi)酯、阿魏酸、芍藥苷和川芎嗪的LC-MS/MS方法，測定該5個有效成分在臨床受試者口服四物湯和四物合劑后所采集的血清中的含量，為四物湯有效成分代表性組分的選擇提供重要依據(jù)。 35位臨床血虛患者隨機(jī)分為四物湯組（n=17）和四物合劑組（n=18），按照臨床用藥劑量早晚各服用一包四物湯或者四物合劑，連續(xù)服用22天。于服藥前及連續(xù)服藥的第22天清晨服藥后1h和2h采集血清樣品。血清樣品前處理采用1.5倍體積的乙腈沉淀蛋白，隨后用LC-MS/MS進(jìn)行分析。 結(jié)果表明，臨床血虛證患者服用中藥復(fù)方四物湯或四物合劑后，在其血清中均檢測到了芍藥苷和藁本內(nèi)酯，兩者含量分別在2.12～18.44和2.18～7.20ng·mL-1的范圍內(nèi)，而梓醇、阿魏酸和川芎嗪則低于檢測限。因此，芍藥苷和藁本內(nèi)酯可作為四物湯有效成分代表性的組分。同時(shí)，藁本內(nèi)酯和芍藥苷在四物湯組中可檢測到的病例數(shù)要明顯多于四物合劑組，推測四物湯更利于有效成分在體內(nèi)的吸收。這些有效成分在體內(nèi)吸收差異是否體現(xiàn)了四物湯和四物合劑的療效優(yōu)劣，對于這個問題，本課題組欲通過高分辨質(zhì)譜的技術(shù)和代謝組學(xué)的方法進(jìn)行研究，目前這部分實(shí)驗(yàn)正在進(jìn)行中。 第五部分四物湯5個有效成分代表性組分組合配伍后在大鼠體內(nèi)的相互作用 通過將四物湯有效成分代表性組分梓醇、藁本內(nèi)酯、阿魏酸、芍藥苷和川芎嗪進(jìn)行組合配伍，考察其在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)相互作用。 將Wistar大鼠隨機(jī)分組為梓醇組、藁本內(nèi)酯組、阿魏酸組、芍藥苷組、川芎嗪組、（梓醇+藁本內(nèi)酯+阿魏酸）組、（梓醇+芍藥苷）組、（梓醇+川芎嗪）組、（梓醇+藁本內(nèi)酯+阿魏酸+芍藥苷）組、（梓醇+藁本內(nèi)酯+阿魏酸+川芎嗪）組、（梓醇+芍藥苷+川芎嗪）組和（梓醇+藁本內(nèi)酯+阿魏酸+芍藥苷+川芎嗪）組，給藥劑量分別為3.5mg·kg-1（梓醇）、100mg·kg-1（藁本內(nèi)酯）、3mg·kg-1（阿魏酸）、100mg·kg-1（芍藥苷）和1mg·kg-1（川芎嗪）。采用灌胃給藥的方式，于給藥前、給藥后不同時(shí)間點(diǎn)采集大鼠血樣。用LC-MS/MS檢測血漿樣品中的有效成分代表性組分的含量。血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)由WinNonlin5.2統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行藥代動力學(xué)參數(shù)的計(jì)算。藥代動力學(xué)參數(shù)的差異由SAS9.2軟件采用單因素方差分析的方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 對于梓醇，與單獨(dú)給藥比較，配伍混合給藥后梓醇的Cmax和AUC明顯減�。≒0.05）。當(dāng)梓醇、藁本內(nèi)酯、阿魏酸、芍藥苷和川芎嗪同時(shí)混合給藥時(shí)，梓醇的在大鼠體內(nèi)的平均滯留時(shí)間MRT明顯長于（梓醇+藁本內(nèi)酯+阿魏酸+川芎嗪）組和（梓醇+芍藥苷+川芎嗪）組中梓醇的MRT （P0.05）。梓醇與其它4個有效成分混合給藥前后，梓醇的生物半衰期T1/2和達(dá)峰時(shí)間Tmax基本保持不變。 對于藁本內(nèi)酯，（梓醇+藁本內(nèi)酯+阿魏酸）組中藁本內(nèi)酯的T1/2和Tmax明顯短于藁本內(nèi)酯單獨(dú)給藥組以及含藁本內(nèi)酯的混合給藥組。而當(dāng)梓醇、藁本內(nèi)酯、阿魏酸、芍藥苷和川芎嗪同時(shí)混合給藥時(shí)，藁本內(nèi)酯的AUC明顯大于藁本內(nèi)酯單獨(dú)給藥組（P0.05）�；旌辖o藥后，藁本內(nèi)酯的平均滯留時(shí)間MRT略短于藁本內(nèi)酯單獨(dú)給藥組（P0.05）。藁本內(nèi)酯與其它4個有效成分混合給藥前后，藁本內(nèi)酯的達(dá)峰濃度Cmax無明顯變化。 對于阿魏酸，混合配伍給藥后，阿魏酸的Cmax與阿魏酸單獨(dú)給藥時(shí)相比明顯減�。≒0.05）。除了（梓醇+藁本內(nèi)酯+阿魏酸）組之外，其它3個配伍給藥組中阿魏酸的AUC明顯小于阿魏酸單獨(dú)給藥組（P0.05）。同時(shí)，當(dāng)梓醇、藁本內(nèi)酯、阿魏酸、芍藥苷和川芎嗪同時(shí)配伍給藥時(shí)，阿魏酸的達(dá)峰時(shí)間Tmax相比阿魏酸單獨(dú)給藥組略顯延長（P0.05），其它配伍給藥組則無顯著變化。 芍藥苷與其它4個有效成分配伍給藥前后，對芍藥苷的主要藥動學(xué)參數(shù)T1/2、Tmax、Cmax和AUC無顯著影響。但當(dāng)梓醇、藁本內(nèi)酯、阿魏酸、芍藥苷和川芎嗪同時(shí)配伍給藥時(shí)，芍藥苷在大鼠體內(nèi)的平均滯留時(shí)間MRT明顯長于（梓醇+藁本內(nèi)酯+阿魏酸+芍藥苷）組中芍藥苷的MRT（P0.05）。 對于川芎嗪，與川芎嗪單獨(dú)給藥相比較，川芎嗪與其它4個有效成分組合配伍給藥后川芎嗪的Cmax和AUC均明顯增大（P0.05）。（梓醇+藁本內(nèi)酯+阿魏酸+芍藥苷+川芎嗪）組與（梓醇+川芎嗪）組和（梓醇+芍藥苷+川芎嗪）組相比較，川芎嗪的Cmax和AUC均明顯增大（P0.05）。同時(shí)，（梓醇+藁本內(nèi)酯+阿魏酸+川芎嗪）組與（梓醇+芍藥苷+川芎嗪）組相比較，川芎嗪的AUC明顯增大（P0.05）。 綜上所述，分別來自四物湯的四味配伍藥材的5個有效成分代表性組分在大鼠體內(nèi)存在復(fù)雜的藥代動力學(xué)相互作用，其潛在的作用機(jī)制尚不完全明確，需待進(jìn)一步的研究。本研究為四物湯有效成分組方制劑的研究提供了有價(jià)值的信息，對四物湯有效成分組方制劑的研究具有重要的指導(dǎo)意義。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R285
【目錄】：

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  本文關(guān)鍵詞：四物湯有效成分代表性組分藥代動力學(xué)相互作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：97451