本文關(guān)鍵詞：土茯苓化學(xué)成分分離及抗炎活性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《廣州中醫(yī)藥大學(xué)》 2014年

土茯苓化學(xué)成分分離及抗炎活性研究

胡夢(mèng)梅  

【摘要】：目的： 為了全面揭示土茯苓抗炎活性物質(zhì)基礎(chǔ),尋找活性強(qiáng)的土茯苓化合物,對(duì)土茯苓化學(xué)成分進(jìn)行深入系統(tǒng)研究,并對(duì)分離得到的化學(xué)成分進(jìn)行抗炎活性評(píng)價(jià),對(duì)落新婦苷進(jìn)行抗炎機(jī)制研究,為合理而有效的應(yīng)用土茯苓提供科學(xué)依據(jù)。 方法： 1.土茯苓活性部位篩選 土茯苓不同部位初步分離：將100g土茯苓用70%乙醇加熱回流提取,提取液減壓濃縮至無醇味,得到的土茯苓總樣上大孔樹脂柱,依次予水、30%乙醇、60%乙醇、95%乙醇梯度洗脫,大致劃分土茯苓化合物極性范圍而得到4個(gè)部位。 土茯苓不同部位成分分析：分別以NaNO2-Al (N03)3-NaOH、Folin-ciocalteu、香草醛-高氯酸、硫酸-苯酚為顯色體系,采用分光光度法對(duì)土茯苓不同部位的總黃酮、總多酚、總皂苷、總多糖含量進(jìn)行初步測(cè)定。 土茯苓不同部位活性評(píng)價(jià)： 抗氧化活性：以抗壞血酸(VC)為陽(yáng)性對(duì)照,分別采用清除DPPH、ABTS自由基法及還原力測(cè)定3個(gè)抗氧化實(shí)驗(yàn)方法,評(píng)價(jià)土茯苓不同部位(12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL)的體外抗氧化活性。 抗炎活性：Griess法檢測(cè)LPS (1μg/mL)和土茯苓不同部位(25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL)共同作用于RAW264.7巨噬細(xì)胞24小時(shí)對(duì)其分泌NO的影響。 2.土茯苓化學(xué)成分分離及結(jié)構(gòu)鑒定：將7Kg土茯苓藥材用70%乙醇加熱回流提取,提取液減壓濃縮至無醇味,得到的土茯苓浸膏上大孔樹脂柱,依次予水、60%乙醇、95%乙醇梯度洗脫,對(duì)60%乙醇洗脫部位進(jìn)行系統(tǒng)的化學(xué)成分研究,利用現(xiàn)代光譜學(xué)技術(shù)(UV, IR, ESI-MS,1H-NMR,13C-NMR, DEPT, HSQC)鑒定化合物結(jié)構(gòu)。 3.土茯苓化合物抗炎活性評(píng)價(jià)： MTT法檢測(cè)土茯苓化合物作用于RAW264.7巨噬細(xì)胞24小時(shí)對(duì)其生長(zhǎng)的影響,篩選安全濃度范圍。 Griess法檢測(cè)LPS(1μg/mL)和土茯苓化合物(安全濃度范圍內(nèi))共同作用于RAW264.7巨噬細(xì)胞24小時(shí)對(duì)其分泌NO的影響。 ELISA法檢測(cè)LPS (1μg/mL)和土茯苓化合物(己鑒定結(jié)構(gòu)的化合物)共同作用于RAW264.7巨噬細(xì)胞24小時(shí)對(duì)其分泌TNF-α的影響。 4.落新婦苷抗炎機(jī)制研究： MTT法檢測(cè)落新婦苷(10μg/mL,20μg/mL,40μg/mL)作用于RAW264.7巨噬細(xì)胞24小時(shí)對(duì)其生長(zhǎng)的影響。 Griess法檢測(cè)LPS (1μg/mL)和落新婦苷(10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL)共同作用于RAW264.7巨噬細(xì)胞24小時(shí)對(duì)其分泌NO的影響。 ELISA法檢測(cè)LPS(1μg/mL)和落新婦苷(10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL)共同作用于RAW264.7巨噬細(xì)胞24小時(shí)對(duì)其分泌TNF-α的影響。 Real-time PCR法檢測(cè)LPS(1μg/mL)和落新婦苷(10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL)共同作用于RAW264.7巨噬細(xì)胞12小時(shí)對(duì)其IL-6、TNF-α和iNOS mRNA表達(dá)的影響。 Western Blot法檢測(cè)LPS (1μg/mL)和落新婦苷(5μg/mL10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL)共同作用于RAW264.7巨噬細(xì)胞1小時(shí)對(duì)其PP65、P-P38、P-JNK、P-ERK1/2信號(hào)通路表達(dá)的影響。 結(jié)果： 1.土茯苓活性部位篩選結(jié)果： 土茯苓藥材提取率為16.7%,土茯苓總樣(TFL-Z)經(jīng)初步分離后得到4個(gè)部位：水部位8.4g (TFL-1),30%乙醇部位4.5g(TFL-2),60%乙醇部位2g(TFL-3),95%乙醇部位0.7g(TFL-4),土茯苓化學(xué)成分隨著洗脫溶劑極性變化而重新分布,其中總黃酮、總酚酸、總皂苷類物質(zhì)主要富集在TFL-2和TFL-3部位(P0.01),多糖類物質(zhì)富集在TFL-1部位(P0.01)。 土茯苓總樣及4個(gè)部位均具有不同的清除DPPH, ABTS自由基能力及還原能力,各部位抗氧化能力差異明顯。其中TFL-2和TFL-3清除自由基能力及還原能力均顯著強(qiáng)于TFL-Z(P0.01),且TFL-2和TFL-3清除ABTS自由基的能力顯著強(qiáng)于VC(P0.01)。 土茯苓總樣及4個(gè)部位在低、中、高濃度(25、50、100μg/mL)對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞釋放NO均表現(xiàn)顯著的抑制作用(P0.01),當(dāng)濃度大于50μg/mL時(shí),作用顯著強(qiáng)于地塞米松(P0.01), TFL-Z、TFL-1、TFL-2、TFL-3、TFL-4印制NO釋放的IC50分別為：92.62μg/mL、81.56μg/mL、58.53μg/mL、65.71μg/mL、51.34μg/mL。 2.從土茯苓中分離得到21個(gè)化合物,鑒定了其中9個(gè)化合物：化合物1為丁香脂素,化合物2為lasiodiplodin,化合物10為丁香酸(syringic acid),化合物12為1,4-二(3,4,5-三甲氧基)-2,3-二羥甲基-1,4-丁二醇(1,4-bis(3,4,5-trimethoxyphenyl)-2,3-bis(hydroxymethyl)-1,4-butanediol),化合物14為(-)-lyoniresinol,化合物15為咖啡酸甲酯(caffeic acid methyl ester),化合物21為反-白藜蘆醇(trans-resveratrol),化合物2、5、8是首次從土茯苓中分離得到。 3.土茯苓化合物作用RAW264.7巨噬細(xì)胞24h,細(xì)胞生長(zhǎng)存活率≥90%的安全濃度范圍分別為：化合物5、11、16濃度≤200μg/mL,化合物4、7、9、14、17、20濃度≤100μg/mL,化合物2濃度≤50μg/mL,化合物3、6、8、13、18濃度≤25μg/mL,化合物1濃度≤10μg/mL,化合物10、15、19、21濃度≤1μg/mL。在安全濃度范圍內(nèi)化合物1、2、5、8、9、10、11、12、14、15、16、21均能不同程度抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞釋放NO(P0.05),化合物1、14能顯著抑制NO和TNF-α的分泌。 4.落新婦苷能與LPS協(xié)同作用激活NF-κB和MAPK信號(hào)通路,使細(xì)胞內(nèi)磷酸化P65、P38、JNK、ERK1/2蛋白表達(dá)上調(diào),同時(shí)能抑制iNOS、TNF-α mRNA炎癥基因表達(dá),抑制炎癥因子NO的分泌(P0.01)。 結(jié)論： 1.土茯苓乙醇提取物具有良好的抗氧化及抗炎活性,其中30%和60%的乙醇洗脫部位是土茯苓主要的活性部位。 2.土茯苓分離純化得到21個(gè)化合物,鑒定了9個(gè)化合物結(jié)構(gòu),其中化合物2(lasiodiplodin)、5、8是首次從土茯苓中分離得到。 3.土茯苓化合物1、2、5、8、9、10、11、12、14、15、16、21能抑制RAW264.7巨噬細(xì)胞分泌NO,化合物1(丁香脂素)和14((-)-lyoniresinol)能同時(shí)抑制RAW264.7巨噬細(xì)胞分泌NO和TNF-a,具有良好的抗炎活性。 3.落新婦苷抑制iNOS和TNF-α mRNA炎癥基因表達(dá),抑制炎癥因子NO的分泌,從而抑制巨噬細(xì)胞過度炎癥反應(yīng),具有抗炎作用。 4.落新婦苷和LPS協(xié)同作用活化NF-κB和MAPK信號(hào)通路,增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的免疫功能,提示落新婦苷可能具有免疫調(diào)節(jié)功能。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R284.1;R285
【目錄】：

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9 白玉彤;秦曼;;加味黃芪土茯苓湯治療老年婦女尿路感染23例[J];中國(guó)民間療法;2006年06期

10 蔣森;;黃柏土茯苓湯治療急性尿路感染100例小結(jié)[J];新醫(yī)藥學(xué)雜志;1977年02期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 陳紅明;;通痹土茯苓湯治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎80例[A];全國(guó)第八屆中西醫(yī)結(jié)合風(fēng)濕病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2010年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 ;[N];醫(yī)藥導(dǎo)報(bào);2007年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 李磊;土茯苓化學(xué)對(duì)照品及質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)研究[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2007年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 劉洪盼;土茯苓方治療兒童咳嗽變異型哮喘的臨床觀察[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2013年

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